纳豆芽孢杆菌FK- 3液体发酵条件优化

■赵彩春　区毅垣　史宝军

（广东海大集团股份有限公司，广东广州511400）



纳豆芽孢杆菌FK- 3液体发酵条件优化

■赵彩春区毅垣史宝军

（广东海大集团股份有限公司，广东广州511400）

摘要：文章旨在研究一株纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)FK-3液体发酵的最佳发酵条件及培养基配方。采用单因素试验以及正交试验，对培养条件如温度、转速、装液量、接种量、初始pH值以及培养基配方的碳源、氮源、无机盐等因素进行研究，试验数据通过SPSS 22软件展开单因素方差分析、正交试验极差分析及方差分析。结果表明，该菌株的最适培养条件是初始pH值为7.5，温度33℃，摇床转速190 r/min，装液量为60 ml/250 ml三角瓶，接种量为4%，种龄是20 h，收获时间为20 h。培养基配方为米糠1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，豆粕4%，酵母膏1.0%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.05%，硫酸锰0.01%。FK-3在15 L发酵罐中发酵活菌量达1.41×1010cfu/ml，芽孢数为1.37×1010cfu/ml，芽孢率为97%。

关键词：纳豆芽孢杆菌；发酵条件；培养基配方；单因素试验；正交试验；SPSS

纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是1906年日本迟村对纳豆进行研究时，分离出得到的一种产蛋白酶益生菌[1]。纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种[2]，其产生的碱性蛋白酶纳豆激酶被发现为最具潜力的口服溶纤蛋白酶[3]，在医药和保健食品等领域得到了广泛的研究和应用，并且纳豆菌也是我国被列入农业部公布允许使用的饲料级微生物添加剂之一[4]。近年来，国内外掀起纳豆激酶的研究和开发热潮，大部分关于纳豆芽孢杆菌的研究主要集中在其本身的生理功能和产物纳豆激酶上，如纳豆激酶高产菌株的筛选、纳豆激酶的纯化[5-8]。相对于纳豆芽孢杆菌其它方面的研究，涉及到纳豆芽孢杆菌发酵工艺摸索的研究以固体发酵形式居多，而关于纳豆芽孢杆菌液体发酵工艺研究则相对较少，国内关于以提高纳豆芽孢杆菌活菌量为目的的液体发酵条件优化的文献非常之少[9-10]。本文以液体发酵出发，研究了纳豆芽孢杆菌FK-3液体发酵活菌量的影响因素，筛选出最适培养条件及培养基配方组成，为该菌株后续应用于微生态制剂提供一定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种来源

纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus natto)为本实验室分离保存并经广东微生物检测中心鉴定。

1.1.2培养基

斜面培养基及活菌计数用培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂15 g，水1 L，pH值7.2。

种子培养基：胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB），购自美国BD。

LB培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，水1 L，pH值7.2。

摸索培养基配方用培养基：玉米粉1%，玉米淀粉2%，酵母膏1%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.05%，硫酸锰0.01%。待选碳源（蔗糖、葡萄糖、乳糖、米糠），待选氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕），待选无机盐（氯化钾，氯化钠，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠）。

1.2试验方法

1.2.1细菌计数

摸索培养条件试验通过发酵液OD600值来检测发酵液中生物量。

摸索培养基配方试验通过稀释涂平板活菌计数来检测发酵液中生物量。

芽孢率(%)=(水浴热处理后样品计数结果/水浴热处理前样品计数结果)×100

1.2.2试验设计

1.2.2.1生长曲线制作

挑取一环菌落接种到种子培养液中30℃，180 r/min培养24 h，按1%接种至装有30 ml LB培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 r/min摇床培养。每隔4 h取样用空白LB稀释10倍后检测OD600值，绘制生长曲线。根据生长曲线确定细菌种龄及收获时间，为后续优化试验做准备。

1.2.2.2培养条件单因素试验

在LB培养基中，分别控制初始pH值（6、7、8、9）、转速（180、200、220 r/min）、温度（30、33、36℃）、装液量(30、40、50、60 ml/250 ml)、接种量(1%、3%、5%、7%)开展试验，根据1.2.2.1节得出最佳培养时间取发酵液稀释10倍检测OD600值，对各单因素试验中发酵液OD600值进行单因素方差分析，筛选出对发酵活菌量具有显著性影响的因素。

1.2.2.3培养条件正交试验

根据1.2.2.2节结果选取显著性影响因素，采用SPSS22设计正交试验，每个因素围绕单因素实验中OD600值最高的处理水平设置3个水平。根据1.2.2.1节生长曲线中的最佳培养时间取发酵液稀释10倍测OD600，通过极差分析及方差分析，得出最佳培养条件组合。

1.2.2.4培养基成分单因素试验

以玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，酵母膏1.0%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.05%，硫酸锰0.01%为固定成分，分别加入不同碳源(蔗糖、葡萄糖、乳糖、米糠)，以1.2.2.3节筛选出的最佳条件组合为培养条件进行碳源单因素试验，活菌计数筛选出最优碳源；分别加入不同氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕），开展氮源单因素试验，筛选出最优氮源；分别加入不同无机盐（氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠），开展无机盐单因素试验，筛选出最优无机盐。

1.2.2.5培养基成分正交试验

根据1.2.2.4节中得出的最优碳源、氮源、无机盐，结合文献资料，设计3因素3水平的正交试验，根据

1.2.2.3节得出的最优培养条件组合开展试验，根据

1.2.2.1节得出的培养时间取发酵液活菌计数，通过极差分析及方差分析，得出最佳培养基配方。

2　结果

2.1生长曲线制作

FK-3的生长曲线如图1所示，FK-3的生长延迟期非常短，在新鲜培养液中能迅速进入增殖状态进入生长数期，在20 h时生物量达到最高，之后进入短暂的平台期，24 h后菌液浓度明显开始下降，菌株生长进入衰退期。因此在后续试验中可选择20 h为菌株种龄。镜检显示FK-3在培养20 h时芽孢率约95%以上，因此20 h也可作为发酵收获时间。

2.2培养条件单因素试验

2.2.1温度对FK-3发酵活菌量的影响温度单因素影响

试验结果如图2所示，经过SPSS软件单因素方差分析，FK-3在33℃条件发酵液稀释10倍OD600达0.764±0.02，在P=0.05水平上显著高于30℃（0.710± 0.02）及36℃（0.452±0.03)。说明温度能显著影响FK-3发酵活菌量，且最适温度为33℃。

图1 FK-3生长曲线

图2温度对FK-3生长影响

2.2.2转速对FK-3发酵活菌量的影响

转速对FK-3发酵活菌量的影响试验结果如图3所示，经SPSS软件AVONA分析表明，180 r/min条件对FK-3发酵活菌量具有显著优势（P＜0.05）。

图3转速对FK-3生长的影响

2.2.3初始pH值对FK-3发酵活菌量的影响

发酵液初始pH值对FK-3发酵活菌量影响如图4所示，FK-3能适应pH值6～8范围，在pH值9完全不生长。经SPSS软件AVONA分析，显示pH值8时菌液浓度显著高于其他条件（P＜0.05）。

图4初始pH值对FK-3生长的影响

2.2.4装液量对FK-3发酵活菌量的影响

装液量对FK-3发酵活菌量的影响如图5所示，经SPSS软件AVONA分析显示，装液量为60 ml时，活菌量显著高于其他体积条件下（P＜0.05），说明装液量对FK-3发酵活菌量影响显著。

图5装液量对FK-3发酵活菌量的影响

2.2.5接种量对FK-3发酵活菌量的影响

接种量对FK-3发酵活菌量的影响如图6所示，经SPSS软件AVONA及Duncan多重比较显示，接种比例为5%时菌量显著高于1%及3%条件下活菌量（P＜0.05），但与接种量7%时无显著差异（p＞0.05），从资源节省角度出发，5%接种量最佳。

图6接种量对FK-3发酵活菌量的影响

2.3培养条件正交试验

根据单因素试验结果，采用SPSS设计4因素3水平正交试验表，如表1所示。

表1 FK-3培养条件正交试验设计因素水平

正交试验结果分析见表2，2次重复试验结果纳入分析，极差分析显示RC＞RD＞RB＞RA，表明各因素对试验结果的影响大小依次为C＞D＞B＞A。最佳组合为A3B1C2D1，即转速190 r/min，pH值7.5，装液量60，接种量4%。

通过SPSS 22对正交试验结果进行方差分析，如图7所示，据第3平方和可看出因素对结果影响大小依次为C＞D＞B＞A,各因素对活菌量均具有显著影响，最佳组合为A3B1C2D1。方差分析与极差分析结果吻合，均表明最佳组合为转速190 r/min，pH值为7.5，装液量为60 ml/250 ml，接种量为4%。

表2 FK-3培养条件正交试验结果分析

图7培养条件正交试验SPSS软件方差分析

2.4培养基成分单因素试验

2.4.1碳源对FK-3发酵活菌量的影响

碳源对FK-3发酵活菌量影响如图8所示，4种碳源中，米糠作为碳源时发酵活菌数最高，经单因素方差分析，米糠作为碳源发酵活菌数高于其它碳源活菌数达到显著水平（P＜0.05）。

2.4.2氮源对FK-3发酵活菌量的影响

氮源对FK-3发酵活菌量影响如图9所示，4种氮源中，豆粕作为氮源时发酵活菌数最高，经单因素方差分析，豆粕作为氮源发酵活菌数高于其它氮源活菌数达到显著水平（P＜0.05）。

2.4.3无机盐对FK-3发酵活菌量的影响

无机盐对FK-3发酵活菌量影响如图10所示，4种无机盐中，磷酸氢二钠处理组发酵活菌数最高,经单因素方差分析，磷酸氢二钠处理组显著优于其它无机盐处理组(P＜0.05)，故选磷酸氢二钠为FK-3发酵的最佳无机盐。

图8碳源对FK-3发酵活菌量的影响

图9氮源对FK-3发酵活菌量的影响

图10无机盐对FK-3发酵活菌量的影响

2.5培养基配方正交试验

根据培养基单因素试验结果，采用SPSS设计3因素3水平正交试验表，如表3所示。

表3培养基组分正交试验设计

培养基组分正交试验结果如下表4所示。

由极差分析结果可看出，RA＞RB＞RC,即各因素对活菌量影响大小依次为米糠＞豆粕＞无机盐。从表中结果可看出最佳理论组合是A2B1C3,正交试验中没有与这个理论组合一致的组合，因此需要按照理论最佳组合开展验证试验。在500 ml三角瓶中活菌量达5.0×109cfu/ml，在15 L发酵罐中活菌量可达1.41× 1010cfu/ml，芽孢数为1.37×1010cfu/ml，芽孢率为97%。

用SPSS软件对正交实验结果进行方差分析，结果如图11所示，从第三方平方和看，米糠＞豆粕＞无机盐，说明3个因素对活菌量影响大小依次是米糠＞豆粕＞无机盐，与极差分析结果一致。其中米糠含量对发酵活菌量的影响显著（P＜0.05）。

表4 FK-3培养基组分正交试验结果

图11培养基配方正交试验SPSS软件方差分析结果

3　结论

纳豆枯草芽孢杆菌FK-3液体发酵受发酵条件影响，如温度，初始pH值，转速，装液量及接种量，这些因素都显著影响着FK-3液体发酵活菌量。培养基组分米糠的含量也显著影响着发酵活菌量水平。本试验筛选的最佳培养基配方组合为：米糠1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，豆粕4.0%，酵母膏1.0%，磷酸氢二钠0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.05%，硫酸锰0.01%，初始pH值7.5，装液量60 ml/250 ml,接种量为4%，33℃，190 r/min，培养20 h。以该培养条件组合在250 ml瓶中发酵活菌量可达5×109cfu/ml，芽孢率约为90%。在15 L发酵罐中发酵中发酵活菌量达1.41×1010cfu/ml，芽孢数为1.37×1010cfu/ml，芽孢率为97%。

参考文献

[1] R E戈登，W C海恩斯，C HN帕格.芽孢杆菌属[M].北京：农业出版社，1983: 42-43.

[2]陈兵，何世山，朱凤仙，等.纳豆芽孢杆菌剂对AA鸡生产性能和十二指肠消化酶[J].浙江农业学报，2003, 15(5): 289-292.

[3]付利，杨志兴.纳豆激酶的研究与应用[J].生物工程进展, 1995, 15(5):46-49.

[4]胡东新，潘康成.微生态制剂及其作用机理[J].中国饲料，2001 (3):14-16.

[5]田亚红，刘辉.豆豉中纳豆芽孢杆菌的筛选及其发酵工艺的研究[J].中国酿造，2009, 4(205):45-48.

[6]孙妍，王加启，奚晓琦，等.高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定[J]. 2010, 41(2):175-180.

[7]甘露.纳豆固态发酵及纳豆激酶没血性质研究[D].硕士学位论文.合肥:安徽农业大学, 2013:1-26.

[8]鞠守勇，曹志林，李金山.一株产纳豆激酶芽孢杆菌分离及鉴定[J].安徽农业科学.2014,42(13):3784-3786.

[9]邓露芳，王加启，姜艳美，等.犊牛饲用枯草芽孢杆菌液体培养条件优化[J].饲料工业，2008,29(6):37-40.

[10]胡亚军，秦丹，唐少娃，等.纳豆芽孢杆菌液体发酵培养条件的优化[J].饲料研究，2014, 17:83-86.

（编辑：王芳，xfang2005@163.com）

Optimization of liquid fermentation condition for Bacillus natto FK-3

Zhao Caichun, Qu Yiyuan, Shi Baojun

Abstract：This experiment was conducted to study the optimization of liquid fermentation condition and medium for a Bacillus natto strain FK-3. The single-factor method and orthogonal experimental method were used to optimize the fermentation condition of initial pH, temperature, rotation speed, in⁃oculation amount and the fermentation medium factors of carbon sources, nitrogen sources and inorgan⁃ic salts. ANOVA and orthogonal test range analysis and variance analysis were conducted by SPSS22. The result showed the optimization condition for Bacillus natto strain FK-3 are as following: initial pH was 7.5, temperature was 33℃, rotation speed was 190 r/min, liquid volume was 60 ml/250 ml, inocu⁃lation amount was 4.0%, fermentation time was 20 h. The optimization medium component are as fol⁃lowing : rice bran 1.0%,corn flour 1.0%,corn starch 2.0%, soybean meal 4.0%, yeast extract 1.0%, Na2HPO40.1%, MgSO40.05%,CaCl20.05%,MnSO40.01%. The bacteria number of FK-3 was 1.41× 1010cfu/ml when fermentation in 15 L fermenter and spores number was 1.37×1010cfu/ml, The spores rate was 97%.

Key words：Bacillus natto；fermentation condition；fermentationmeduim；single-factor experimental；or⁃thogonal experimental；SPSS

收稿日期：2015-10-21

作者简介：赵彩春，硕士，主要从事水产养殖微生态制剂研究。

中图分类号：S816.6

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）03-0039-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.03.008