鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

仇保丰，宋鸿雁，严若峰，宋小凯，徐立新，李祥瑞*

(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095；2.南通出入境检验检疫局，江苏南通 226004；3.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001)



研究论文

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

仇保丰1,2，宋鸿雁1,3，严若峰1，宋小凯1，徐立新1，李祥瑞1*

(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095；2.南通出入境检验检疫局，江苏南通 226004；3.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001)

摘要:为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力，分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板，用RT-PCR扩增出SO7基因片段，再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示，pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40 ku，主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示，SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用，能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI)，对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。

关键词:柔嫩艾美耳球虫；SO7基因；克隆；表达；免疫效力

鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的消化道寄生虫病，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的危害最大[1-2]。长期以来，鸡球虫病主要靠化学药物来控制，但抗药性虫株的迅速出现、研制新药的高额费用、药物残留的安全问题等迫使人们去寻求控制鸡球虫病的新途径[3-4]。近年来，包括基因工程疫苗和核酸疫苗在内的各类球虫疫苗已引起了人们的高度关注[5-6]。目前，已有大量编码球虫保护性抗原的基因被发现，藉此研制的新型疫苗也展示了广阔的应用前景。SO7基因是Profous-Juchelka利用柔嫩艾美耳球虫子孢子多抗从柔嫩艾美耳球虫部分孢子化卵囊的λgtll cDNA表达文库中筛选出来的。研究表明，该基因编码的蛋白具有良好的免疫原性，能减轻柔嫩艾美耳球虫强毒攻击后的病变程度，而且能产生与E.maxima、E.acervulina、E.necatrix的交叉免疫力[7]。但是当前对SO7基因体外表达蛋白的免疫保护效力仍存在争议。本研究旨在对柔嫩艾美耳球虫江苏株的SO7基因进行克隆、表达，进而研究体外重组蛋白对鸡柔嫩艾美耳球虫的保护作用，为消除相关争议和研制鸡球虫新型疫苗提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1艾美耳球虫卵囊和试验用鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊分离自江苏南京地区某鸡场，由南京农业大学兽医寄生虫分子免疫学实验室鉴定并保存。90只1日龄AA肉鸡购自南京迈皋桥鸡场，饲养于严格消毒无球虫的笼舍中，饲喂的饲料中不含抗球虫药。

1.1.2试剂DEPC为Amresco公司产品；蛋白分子质量标准、M-MLV和TaqDNA聚合酶均为Promega公司产品；pMD18-T载体、dNTP、DNA Marker DL 2 000 、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶为宝生物工程(大连)有限公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100为华美生物工程公司产品。

1.2方法

1.2.1SO7基因的克隆与分析根据GenBank已公布的SO7基因序列(登录号: X15898.1)，用Primer Premier 5.0软件设计1对扩增引物：P1，5′TTC GGA TCC ATG GCA GAC CTC TTC AGC3′；P2，5′GAG GAA TTC TTA CCA GAA GAA GCC GGA3′，画线部分为BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增产物的预期长度约为670 bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。参照文献[8]的方法增殖和纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊，再用一步法[9]提取总RNA，并进行反转录。以反转录产物为模板进行SO7基因的PCR扩增，PCR体系为：10×Taqbuffer 5.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 3.0 μL，dNTP (2.5 mmol/L each) 4.0 μL ，引物P1和P2(50 pmol/ L)各1.0 μL，TaqDNA聚合酶(20 U/μL)0.5 μL，cDNA模板2.5 μL，灭菌双蒸水33.0 μL。PCR循环条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 15 min。循环反应完毕后,在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳并在紫外灯下观察结果。回收目的条带后连接pMD18-T载体并转化Dpα，用双酶切和PCR鉴定出阳性克隆，并挑取3个克隆送宝生物工程(大连)有限公司测序，对测序结果进行分析。

1.2.2原核表达质粒pET32a(+)-SO7的构建将鉴定正确的pMD18-T-SO7和pET32a(+) 2种质粒分别用BamHⅠ+EcoRⅠ双酶切，回收、连接后转化BL21大肠埃希菌，挑取单个菌落进行pET32a(+)-SO7阳性质粒鉴定，鉴定方法同1.2.1。

1.2.3SO7重组蛋白的表达及纯化参照文献[9]的方法用IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)诱导重组菌pET32a(+)-SO7表达，同时设空载体菌pET32a(+)作为对照，诱导条件一致。分别取0～6 h菌液1 mL用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。参照文献[9]用尿素从大肠埃希菌包涵体中纯化表达蛋白，大体积PBS(pH 7.0)低温透析去除蛋白中的尿素，再用PEG20000浓缩包涵体蛋白，分光光度计测量蛋白浓度，取10 μL用SDS-PAGE电泳检测包涵体提取、纯化的效果。

1.2.4重组蛋白的免疫保护性试验当试验鸡饲养至14日龄时随机分成3组，每组30只，进行免疫保护性试验。按文献[10]的方法设立盲肠病变计分、每克盲肠内容物卵囊值(oocysts per gram, OPG)、平均增重、抗球虫指数(anticoccidial index, ACI)4个常用指标对SO7重组蛋白免疫原性进行综合评价。将含有200 μg蛋白或不含蛋白的PBS溶液100 μL按照表1的程序和方法，肌肉注射免疫试验鸡，二免后1周经口接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊对重组蛋白组和非免疫攻虫组进行攻虫试验，接种卵囊数为5×104个/羽，非免疫非攻虫组则仍以PBS代替(表1)。免疫和攻虫的同时对每只鸡分别称重，攻虫后1周处死所有试验鸡，并分别称重、盲肠病变计分和盲肠内容物卵囊计数。用SPSS软件进行平均数和方差计算，分析各组之间的差异显著性。

表1　SO7重组蛋白抗柔嫩艾美耳球虫免疫保护试验

2结果

2.1SO7基因的克隆与鉴定

SO7基因RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现第1、2、3泳道均有约670 bp的条带，与预期大小相吻合(图1)。将目的条带回收、连接pMD18-T克隆载体。提取质粒经双酶切和PCR鉴定均能获得目的条带。挑取3个阳性克隆送出测序并进行Blast比对，结果显示，本研究所扩增的SO7基因与GenBank内已公布的SO7基因(登录号: X15898.1)同源性最高，碱基同源性为99.8%，推导的氨基酸同源性为100%，说明成功克隆到了SO7基因。

M. DNA标准DL 2 000; 1～4.SO7基因RT-PCR扩增产物

M. DNA Marker DL 2 000; 1-4.RT-PCR products of SO7 gene

图1SO7基因RT-PCR扩增结果

Fig.1Amplification of SO7 gene by RT-PCR

2.2重组质粒pET32a(+)-SO7的构建及原核表达

将SO7基因由质粒pMD18-T-SO7中用EcoRⅠ+BamHⅠ切下，克隆入pET32a(+)后提取质粒，经酶切、PCR和测序鉴定表明，原核表达载体pET32a(+)-SO7被成功构建。

将pET32a(+)-SO7和pET32a(+)空载体菌对照分别诱导表达，SDS-PAGE电泳结果显示，SO7基因高效表达，重组蛋白约为40 ku，与预期一致(图2)。进一步分析发现，表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在，菌液中分泌性表达的蛋白很少。用尿素对包涵体蛋白进行提纯并用SDS-PAGE检测纯化效果，结果表明纯化效果较理想(图3)。

M. 蛋白分子质量标准；1～2. 空载体pET32a (+)菌液诱导0和4 h的样品；3～9. 分别为重组菌诱导0～6 h时的样品

M. Protein molecular weight Marker; 1-2. The control products of pET32a (+) without aim gene induced in 0, 4 hour; 3-9. The expression products of recombinant plasmid of pET32a (+) -SO7 in 0-6 hours respectively

图2重组质粒pET32a(+)-SO7的诱导表达

Fig.2Induced expression of recombinant plasmid of pET32a(+)-SO7

M. 蛋白分子质量标准；1～2. 纯化的包涵体蛋白

M. Protein molecular weight marker; 1-2. Purified proteins of inclusion bodies

图3SDS-PAGE检测纯化的包涵体蛋白

Fig.3Detection of purified inclusion bodies by SDS-PAGE

2.3重组蛋白的免疫保护性试验

SO7基因表达的重组蛋白和对照组动物试验表明(表2)，在平均增重方面，重组蛋白免疫组和非免疫非攻虫组之间的差异不显著(P>0.05)，但两者与非免疫攻虫组的差异均显著(P<0.05)，说明SO7重组蛋白免疫鸡后能显著降低因柔嫩艾美耳球虫感染所造成的体重减轻和饲料转化率降低。OPG值数据表明，3组动物之间的差异均为显著(P<0.05)，这说明SO7重组蛋白对减少柔嫩艾美耳球虫感染鸡的球虫卵囊数有一定作用，但不能将卵囊完全消除或降至极低。盲肠病变计分的统计分析结果与OPG值相似，说明SO7重组蛋白对减轻因柔嫩艾美耳球虫感染造成鸡的盲肠肿大、出血等病变也有部分保护效果。抗球虫指数(ACI)是一个评价疫苗优劣的综合性指标，其判定标准是：ACI≥180为保护效果明显，ACI=160~179为保护效果一般，ACI<160为无保护效果[10]。从表2可以看出，SO7基因表达的重组蛋白对鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染有明显的免疫保护效果(ACI>180)。

表2　SO7重组蛋白对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护作用

注：表中同一列中含相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含相同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：In the same column, values with the same letters were not significantly different (P>0.05), and with the different letters were significantly different (P<0.05).

3讨论

目前，国内外学者一致认为柔嫩艾美耳球虫的SO7蛋白为鸡球虫有效的保护抗原之一，其保护效力已被SO7核酸疫苗的研究报道予以证实。但是，对于SO7体外重组蛋白是否具有保护效力这一问题，不同的研究小组间仍有不同意见。Klotz C等[11]将SO7基因分别插入2种真核表达载体构建核酸疫苗，结果2种核酸疫苗肌肉注射后均将能产生免疫保护作用。Crane M S等[12]认为，原核表达的SO7融合蛋白仍具有生物学功能，能够与特异性抗血清反应；用提纯的重组蛋白SO7抗原1次肌肉注射免疫2日龄~4日龄鸡，3周后鸡能产生对E.tenella、E.maxima、E.acervulina攻虫的部分保护力。国内也有人研究发现，试验鸡经过SO7重组蛋白100 μg剂量3次免疫后，能够产生对柔嫩艾美耳球虫的部分保护力，使其病变计分比未免疫组下降31%[13]。丁熙成等[14]对SO7基因原核表达蛋白的研究也发现，该蛋白在减轻鸡肠道病变、降低肠内容物卵囊数和提高相对增重等方面有不同程度的作用。Kopko S H等[15]研究发现，球虫活苗和25 μg剂量的SO7核酸疫苗对减轻柔嫩艾美耳球虫感染鸡的盲将肠病变和提高鸡的相对增重方面有显著效果，而使用1 μg SO7重组蛋白加弗氏佐剂来免疫鸡则没有这方面的保护效力。

为了确认SO7体外重组蛋白的免疫原性，为鸡球虫核酸疫苗和基因工程疫苗研究筛选理想的保护性抗原，本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的克隆、表达和SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力进行了系统的研究。研究结果表明，SO7基因ORF编码区序列被成功克隆，SO7重组蛋白也在大肠埃希菌中高效表达和提纯(图2和图3)。随后进行的重组蛋白保护性试验结果显示，SO7原核表达蛋白对提高鸡的平均增重有显著作用，这与丁熙成等[14]的试验结果相吻合，但与Kopko S H等[15]研究者的结果不一致。具体分析其原因：虽然从理论上来说，核酸疫苗和体外表达蛋白接种动物应该具有相同效果，但实际情况并非如此，因为蛋白直接接种至体内容易被蛋白酶水解，存留时间较短，所以抗原需求量大且常常需要多次注射并使用免疫佐剂才能达到理想效果，而核酸疫苗可在动物体内存留较长时间，且载体携带的外源基因可不断转录、翻译成蛋白，持续刺激机体产生免疫保护作用。上述分析，一方面可以解释为何Kopko S H等[15]在研究中发现25 μg SO7核酸疫苗和1 μg SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中的截然相反的试验结论；另一方面，也为分析丁熙成等[14]和Kopko S H等[15]2个研究小组对SO7重组蛋白的抗柔嫩艾美耳球虫免疫效力的不同结论提供思路，因为前者的重组蛋白接种量(100 μg～200 μg)远远大于后者的接种量(1 μg)。不仅如此，已有研究证实，SO7融合蛋白只有在大剂量(100 μg)和多次免疫鸡的情况下，才能对柔嫩艾美耳球虫的感染产生部分保护力，而小剂量(10 μg )未见保护力[13]。

正因如此，本研究参考了大量资料，最终确定使用200 μg SO7重组蛋白和2次免疫的试验方案，目的是使获得的数据能真实的反映重组蛋白的保护效力。试验结果表明，SO7重组蛋白对提高鸡的平均增重有显著作用。同时，对减轻鸡盲肠病变和降低卵囊数也有一定的保护作用，但是不能达到完全保护，这也与其他一些研究者[13-14]的试验结果一致。另外，从ACI这个综合指标还能看出，SO7原核表达蛋白对鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染具有明显保护作用。所以，总的来说，SO7重组蛋白是比较理想的保护性抗原。因此，对SO7等保护抗原的利用方式、有效用量、免疫程序和佐剂选择等问题均应该进行系统深入地研究，以便早日实现合理、有效的开发和利用。

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Prokaryotic and Expression of SO7 Gene from ChickenEimeriatenellaand Animal Immunization Test of Its Recombinant Protein

QIU Bao-feng1,2, SONG Hong-yan1,3, YAN Ruo-feng1,SONG Xiao-kai1, XU Li-xin1, LI Xiang-rui1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210095,China；2.NantongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Nantong,Jiangsu,226004,China;3.LaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China)

Abstract:To study the immune efficacy of recombinant protein, which was obtained with the expression SO7 gene of Eimeria tenella in Escherichia coli, and evaluate the immunization effects of recombinant protein on the average body-weight gain, anti-coccididal index (ACI), caecal lesions scores and oocyst output during the course of chickens against E.tenella infection. The SO7 gene was amplified from total RNA of E.tenella sporulated oocysts by RT-PCR. By the means of DNA recombination technique, SO7 gene was cloned into prokaryotic expression vector of pET32a(+), and the proteins were expressed by induction of IPTG. As the results of SDS-PAGE indicated, pET32a(+)-SO7 could express the SO7 gene, and most of the recombinant proteins were existed in the inclusion bodies with a molecular mass of approximately 40 ku. Using the purified proteins, the animal immunization test was carried out, and the results showed that the recombinant protein of SO7 gene share an ideal immunoprotective effect, the average body-weight gain and the anticoccididal index of chickens challenged with Eimeria tenella could be significantly increased, and the caecal lesion scores and oocyst output could also be partly alleviated.

Key words:Eimeria tenella; SO7 gene; cloning; expression; immune efficacy

文章编号:1007-5038(2016)02-0001-05

中图分类号:S852.723；Q786

文献标识码:A

作者简介：仇保丰(1978-)，男，安徽长丰人，兽医师，博士，主要从事动物及动物产品病原体的检测及研究。 *通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(31372428;31201896)

收稿日期：2015-06-22