大豆分离蛋白-乙二胺接枝物的合成及性质

袁 明 昆，　许 　 楚，　周 景 辉

( 大连工业大学 轻工与化学工程学院, 辽宁 大连　116034 )



大豆分离蛋白-乙二胺接枝物的合成及性质

袁 明 昆，许 楚，周 景 辉

( 大连工业大学 轻工与化学工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:探讨了以1-(3-二甲氨基丙基-3)-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化大豆分离蛋白(SPI)的羧基和乙二胺(EDA)的氨基进行接枝反应制备大豆分离蛋白-乙二胺接枝物(SPI-EDA)的最佳条件。利用激光粒度/Zeta电位仪、FT-IR、HPLC、PCD等对SPI-EDA接枝物进行结构与性质表征。确定适宜的合成条件：反应温度为室温，时间4 h， SPI、EDC、EDA与 NHS摩尔比1.0∶0.5∶0.6∶0.125。检测结果表明，EDA成功的接枝到SPI羧基基团上，与SPI相比，SPI-EDA的电荷密度、相对分子质量等都有所改善，接枝物SPI-EDA聚集体粒径增大且分布均一。

关键词:大豆分离蛋白(SPI)；1-(3-二甲氨基丙基-3)-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；乙二胺(EDA)；大豆分离蛋白-乙二胺接枝物(SPI-EDA)

0引言

目前造纸助剂大多数都是化石基产品，由于其不可再生和不可降解性，造纸助剂的发展趋势是转向可再生生物基资源的产品，如淀粉[1]、瓜尔胶[2]、纤维素[3]、壳聚糖[4]等。大豆分离蛋白(SPI)是大豆生产油料等产品后的副产物，来源集中、产量较大、成本低，属于可降解可再生资源。SPI大量用于饲料，也有用其作为食品添加剂、膜材料、胶黏剂等原料[5]。

由于SPI上的谷氨酸和天门冬氨酸等氨基酸都含有自由羧基，两者约占总的氨基酸单元的35%[6]，导致SPI在浆料中带负电，不符合造纸助剂带正电荷的要求，因此如要把SPI用作造纸助剂，有必要对其进行化学改性。如能在SPI羧基端接枝上氨基基团使之具有类似聚乙烯亚胺(PEI)的结构，就可以满足造纸助留助滤剂所要求的高分子和正电性，从而可以将其用作造纸助剂[7]。

碳二亚胺类催化剂(EDC)催化反应具有高效、低温、水性等优点，常被用于催化羧酸和伯胺间的接枝反应，很适合大分子的温和改性。EDC催化接枝反应还可以被用于多肽[8]、纤维素[9]和明胶[10]等大分子的改性等。其反应机理是：EDC通过酰胺结合与SPI结构中的谷氨酸和天门冬氨酸残基上的羧基形成活泼的共价偶联物O-异酰基脲中间体，随后乙二胺(EDA)上的伯胺通过亲核攻击，最终与SPI上的羧基形成酰胺交联[11-12]。

本实验利用EDC和NHS催化SPI上的羧基和EDA上的氨基进行接枝反应，探索了SPI-EDA接枝物的最佳制备条件，并通过激光粒度/Zeta电位仪、FT-IR、HPLC、PCD等对SPI-EDA接枝物进行结构与性质表征，旨在扩大SPI的用途，开发新的造纸助剂品种。

1实验

1.1原料与仪器

原料：大豆分离蛋白(SPI，w(分离蛋白)≥90%)，山东东营万德福公司；乙二胺(EDA)，上海晶纯生化科技股份有限公司，纯度为99%；1-(3-二甲氨基丙基-3)-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，阿达玛斯试剂有限公司，纯度为99%；N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，国药化学试剂有限公司，纯度均为99%；2-(N-吗啡林)乙撑磺酸(MES)，北京索莱宝科技有限公司，纯度为90%。

仪器：Nano-ZS90 Zeta电位仪，英国Malvern公司；PCD-04颗粒电荷滴定仪，德国BTG公司；Frontier傅里叶变换红外光谱仪，PerkinElmer公司；SCL-10AVP高效液相色谱，日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1SPI-EDA的合成

在圆底烧瓶中分别加入不同摩尔比例的SPI、EDC、NHS、EDA，以MES为缓冲液调pH至5.5，升温至反应温度，保温一段时间后，取出冷却到室温。反应后溶液产物用丙酮沉淀、水溶，重复水溶/丙酮沉析的纯化过程3次，最后在冷冻干燥至完全脱水。

1.2.2反应产物Zeta电位和粒径的测定

称取一定量的绝干改性样品配制成质量分数为0.1%溶液(pH=7)，用Nano-ZS90仪器测Zeta 电位，测定温度25 ℃，重复测定6次以上，取平均值。反应产物的粒径同样用Nano-ZS90仪器测定，测定范围5 nm～10 μm。

1.2.3反应产物FT-IR测定

取少量绝干样品与KBr晶体按质量比约1∶100进行研磨，用傅里叶红外光谱仪进行FT-IR测定，测定波段为4 000～400 cm-1，扫描次数为32次。

1.2.4反应产物电荷密度的测定

称取一定量的绝干改性样品配制成质量分数为0.01%溶液，取10 mL改性样品溶液于PCD-04颗粒电荷分析仪中，用阳离子聚电解质或阴离子聚电解质标准滴定液进行滴定，测定改性样品的电荷密度。电荷密度计算公式：

CD=cV/m

(1)

式中：CD为反应产物电荷密度，mmol/g；c为阳离子聚电解质溶液或阴离子聚电解质的浓度1.0 mmol/L；V为消耗的标准阳离子聚电解质或阴离子聚电解质的体积，mL；m为用于滴定溶液中样品质量，g。

1.2.5反应产物相对分子质量的测定

SPI、SPI-EDA的相对分子质量分布范围采用高效液相色谱结合TSK-gel G4000-SWxl(7.8 mm×30.0 cm)凝胶过滤色谱柱测定。进样量：20 μL；进样质量浓度：0.5 mg/mL；检测波长：220 nm。流动相：0.01 mol/L NaH2PO4，0.1 mol/L Na2SO4缓冲溶液(含0.1%SDS)。洗脱体积流量：0.7 mL/min。相对分子质量标准品分别选用肌球蛋白(200 ku)、β半乳糖苷酶(116 ku)、磷酸酶b(97.2 ku)、牛血清蛋白(66.4 ku)、卵清蛋白(43 ku)。对凝胶过滤色谱而言，相对分子质量的对数与保留时间呈线性相关，经过计算所得相对分子质量标准曲线为lgMw=-0.099 1t+6.140 2，R2=0.929。

2结果与讨论

2.1SPI-EDA合成结果与分析

2.1.1EDC用量对SPI-EDA合成的影响

Zeta电位是指带电颗粒表面剪切层的电位，可作为表征粒子表面静电荷的一个重要参数[13]。SPI是典型的两性聚电解质，在其多肽链上有许多极性基团和非极性基团，在水溶液中亲水性的极性基团暴露在SPI表面，使SPI表面带电。所以当EDA接在SPI上，其表面的电荷也会发生变化，因此可用Zeta电位来表征其不同接枝条件的表面电荷变化情况。

在反应温度30 ℃，反应时间为4 h，SPI、EDA、NHS摩尔比为1.0∶1.0∶1.0时，考察EDC用量对SPI-DEA合成反应的影响。由图1中可以看出，随着EDC用量的增加，改性产物的Zeta电位急剧增加，当SPI与EDC摩尔比超过2∶1后，Zeta电位则增加缓慢。这是因为SPI多肽链上的自由羧基被EDC活化生成共价偶联物O-异酰基脲中间体，这种中间体能够迅速与EDA上的氨基发生反应，从而消耗了SPI多肽链上一定量的羧基。继续增加EDC用量，羧基已基本全部被活化参与了反应，反应慢慢达到了平衡。因此适宜的SPI与EDC摩尔比为2∶1。

图1　EDC用量对SPI-EDA的Zeta电位的影响

2.1.2EDA用量对SPI-EDA合成的影响

在反应温度30 ℃，反应时间为4 h，SPI、EDC、NHS摩尔比为1.0∶0.5∶1.0时，考察EDA用量对SPI-DEA合成反应的影响。由图2中可以看出，随着EDA用量的增加，改性产物的Zeta电位逐渐增加，但SPI与EDA摩尔比超过5∶3后，Zeta电位基本不变。这是因为随着EDA用量的增加，EDA与中间体接触的概率增加，SPI多肽链上自由羧基与EDA上的氨基反应生成酰胺从而使SPI表面电荷发生转变。而当SPI与EDA用量之比超过5∶3之后，Zeta电位增加趋于平缓。这是因为此时SPI羧基基本被氨基取代。因此适宜的SPI与EDA摩尔比为5∶3。

图2　EDA用量对SPI-EDA的Zeta电位的影响

2.1.3NHS用量对SPI-EDA合成的影响

由在反应温度30 ℃，反应时间为4 h，SPI、EDC、EDA摩尔比为1.0∶0.5∶0.6时，考察NHS用量对SPI-DEA合成反应的影响。由图3可以看出，随着NHS用量的减少，Zeta电位基本不变，但是当EDC与HNS摩尔比小于4∶1时，Zeta电位开始降低。这是因为EDC与SPI多肽链上的羧基生成的是一种不稳定的中间体，这种中间体如不与氨基立即反应，就会很快水解并重新释放出羧基基团。一定量的NHS存在，可以将O-异酰基脲中间体转化为氨基反应活性的NHS酯，与氨基反应的速度相比，NHS酯的水解要缓慢得多，从而大大提高了EDC主导的接枝反应的效率[14]。因此EDC与NHS最适宜的摩尔比为4∶1。

图3　NHS用量对SPI-EDA 的Zeta电位的影响

2.1.4反应时间对SPI-EDA合成的影响

在反应温度30 ℃，SPI、EDC、EDA、NHS摩尔比为1∶0.5∶0.6∶0.125时，考察反应时间对SPI-DEA合成反应的影响。由图4可以看出，随着反应时间的增加，Zeta电位开始急剧增加，这是因为反应之初，SPI多肽链上有大量未参与反应的羧基。而随着反应时间的增加，Zeta电位开始缓慢增加。这是因为在反应体系中羧基与氨基含量是一定的，随着反应时间的增加，羧基和氨基会不断地被消耗掉，当反应时间超过4 h后，Zeta电位基本保持恒定，据此可以认为羧基和氨基基本被耗尽。因此最适宜的反应时间为4 h。

图4　反应时间对SPI-EDA Zeta电位的影响

2.1.5反应温度对SPI-EDA合成的影响

在反应时间为4 h，SPI、EDC、EDA、NHS摩尔比为1∶0.5∶0.6∶0.125时，考察反应温度对SPI-DEA合成的影响。由图5可见，随着温度的增加，Zeta电位变化不大。这是因为EDC催化剂具有高效、低温等优点，在较大的温度范围都可以发挥良好的催化效果。因此为节约成本，无须刻意控制温度，合成反应在室温下进行即可。

图5　反应温度对SPI-EDA Zeta电位的影响

2.2SPI-EDA 红外表征

图6　SPI和SPI-EDA的红外谱图

图7(a)和图7(b)分别是SPI和SPI-EDA结合去卷积化和二阶导数对酰胺I带进行拟合的图谱。酰胺I 带对于研究蛋白质二级结构最有价值，它是由蛋白质不同二级结构的谱峰分量叠加形成的，通过拟合可以研究改性前后酰胺Ⅰ带中α-螺旋、β-折叠、β-转角等二级结构的比例。一般认为1 650～1 658 cm-1为α-螺旋，1 610～1 640 cm-1为β-折叠，1 660～1 700 cm-1为β-转角，1 650～1 640 cm-1为无规卷曲[16]。通过拟合结果可以发现，SPI-EDA相对于SPI，α-螺旋比例增加了6.48%，β-折叠比例减少了17.38%，β-转角比例减少了1.52%，无规卷曲比例增加了12.42%。这是因为SPI中谷氨酸和天门冬氨酸在SPI中主要是β-折叠形式存在的[17-18]，EDA接枝到这两个氨基酸羧基基团上，改变了SPI原本的空间结构，导致二级结构β-折叠比例减少。这些二级结构比例的变化，可以间接地说明EDA成功地接枝到谷氨酸和天门冬氨酸羧基基团上。

(a) SPI

(b) SPI-EDA

图7SPI和SPI-EDA 酰胺Ⅰ带的拟合曲线

Fig.7FTIR curve fitting of SPI-EDA and SPI-EDA

in amideⅠ

2.3SPI-EDA电荷密度的表征

表1为SPI、SPI-EDA的电荷密度。从表中可以看出，未改性的SPI电荷密度为-0.319 mmol/g，而SPI接枝EDA后电荷由负转正为0.070 mmol/g。因为在水溶液中SPI表面暴有大量的羧基基团，羧基在水溶液中电离主要以 —COO— 形式存在[19]。而EDA接枝SPI多肽链上不仅消耗了羧基基团，还增加了SPI表面的氨基基团的数量，从而可以提高SPI接枝后的电荷密度。

表1　SPI和SPI-EDA 的电荷密度

2.4SPI-EDA聚集体的表征

由图8是SPI和SPI-EDA粒径分布图，可以看出 SPI平均流体力学半径为143 nm，这与文献中提到的结果相近[20]，而SPI-EDA平均流体力学半径为251 nm，且SPI-EDA较SPI粒径分布较为均一。这是因为大豆分离蛋白多肽链上接上了含有氨基(—NH2)的EDA，接上的氨基与SPI本身的氨基基团发生相互排斥，使得SPI-EDA聚集体变得松散，聚集体的平均流体力学半径增大。

2.5SPI-EDA相对分子质量的表征

图9为SPI和SPI-EDA的高效液相色谱图，表2为SPI和SPI-EDA的各成分保留时间与质量分数对照表。从图10中可以看出，SPI和SPI-EDA分子质量的出峰时间为7.51、17.63、18.73 min，由此根据分子质量标准曲线lgMw=-0.099 1t+6.140 2可计算出两者的分子质量主要为248.8、24.7、19.1 ku。从表2中可以看出，SPI中不同分子质量组分所占的比例分别为8.45%、19.39%、72.16%，而SPI-EDA不同分子质量的组分比例为8.6%、74.86%、16.51%。通过对比可以发现分子质量为248.8 ku的组分比例基本不变，而分子质量为24.7和19.1 ku的组分变化明显，两者比例分别由19.39%增加到74.86% 和72.16%减小到16.51%。从中不难发现SPI接枝EDA后，主要是分子质量为19.1 ku组分与EDA发生了接枝。很可能这3种分子质量类型的聚集体是SPI中能够保持较为稳定的状态的组分。可能是分子质量较大的组分与小分子EDA(相对分子质量为60.10)接触的空间位阻大于分子质量较小的组分。

(a) SPI

(b) SPI-EDA

图8SPI和SPI-EDA 粒径分布图

Fig.8Particle size distribution of SPI-EDA

图9　SPI和SPI-EDA的高效液相色谱图

表2SPI和SPI-EDA各成分保留时间与百分含量对照表

Tab.2TheretentiontimeandthepercentageofthecontentsoftheSPIandSPI-EDA

样品t/min分子质量/kuw/%7.51248.88.45SPI17.6324.719.3918.7519.172.167.51248.88.60SPI-EDA17.6324.774.8618.7519.116.51

3结论

(1)SPI接枝EDA的最佳实验条件：反应温度为室温，反应时间4 h，大豆分离蛋白(SPI)、1-(3-二甲氨基丙基-3)-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、乙二胺(EDA)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用量摩尔比为1.0∶0.5∶0.6∶0.125。

(2)红外光谱分析证明EDA与SPI形成了化学连接。在二级结构中，接枝物SPI-EDA相对于SPI，α-螺旋增加了6.48%，β-折叠减少了17.38%，β-转角减少了1.53%，无规卷曲增加了12.42%。

(3)与SPI相比，SPI-EDA接枝物的电荷密度从-0.319 mmol/g增加到+0.070 mmol/g，聚集体的平均粒径从143 nm增加到251 nm左右。

(4)SPI-EDA与SPI对比可以发现分子质量为248.8 ku的组分比例基本不变，而分子质量为24.7和19.1 ku的组分变化明显。两者比例分别由19.39%增加到74.86%和72.16%减小到16.51%。

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Synthesis and properties of grafted copolymers based on soy protein isolated with ethylenediamine

YUANMingkun,XUChu,ZHOUJinghui

( School of Light Industry and Chemical Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Grafted copolymer (SPI-EDA) was prepared by grafting reaction between the free carboxylic acid groups of soy protein isolate (SPI) and the amino groups of ethylenediamine (EDA) using 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) as the condensing agents. The optimal condition for synthesis of SPI-EDA was as follows: room temperature of reaction temperature, 4 h of reaction time, 1∶0.5∶0.6∶0.125 molar ratio of SPI, EDC, EDA and NHS. The chemical structure and physical property of SPI-EDA was analyzed by laser particle size/Zeta potential, FT-IR, HPLC and PCD, respectively. The results revealed that EDA was grafted onto the carboxyl group of SPI. The charge density and molecular weight of SPI-EDA were improved compared with SPI, and the size of SPI-EDA aggregates was increased and the distribution was uniform.

Key words:soy-protein-isolate; 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethyl-carbodiimidehydrochloride; ethylenediamine, soy protein isolate-ethylenediamine graft copolymer(SPI-EDA)

作者简介:袁明昆(1991-)，男，硕士研究生；通信作者：周景辉 (1957-)，男，教授.

基金项目:国家科技支撑计划项目(2013BAC01B03).

收稿日期:2015-09-07.

中图分类号:TS727

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)01-0023-06