三七内生菌的分离及其产皂苷发酵条件的优化

刘 　 莹，　侯 英 敏，　孙 业 兵，　张 宗 申，　金 朝 霞

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



三七内生菌的分离及其产皂苷发酵条件的优化

刘 莹，侯 英 敏，孙 业 兵，张 宗 申，金 朝 霞

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:从三七的种子和根等部位分离三七内生菌，分离纯化后共获得三七内生菌11株。用薄层层析法对发酵液中皂苷类活性物质进行定性检测，并采用香草醛-硫酸显色法定量分析发酵液中皂苷的含量，筛选出一株可以产皂苷的内生菌株N3。生理生化鉴定和16S rDNA基因序列同源性比对分析结果表明，此株菌为肠杆菌属(Enterobacter)。通过单因素试验，确定内生菌株N3最适发酵条件为以蔗糖为碳源，牛肉膏为氮源，pH 7.0，温度28 ℃。

关键词:三七；内生菌；皂苷

0引言

植物内生菌是在一定阶段或全部阶段生活于健康植物根、茎、叶等组织内的真菌或细菌，不会使宿主表现出外部病症，是植物微生态系统中重要的组成成分[1-3]。植物内生菌主要可分为内生真菌、内生细菌、内生放线菌三类[4-6]。目前已报道的植物内生菌有假单胞菌属、肠杆菌属等[7]，可产生紫杉醇、抗菌活性物质以及其他活性物质，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等[8-9]。

内生菌生活在药用植物体内，与药用植物的“协同进化”关系使一些内生菌具有产生与植物相同或相似的生物活性物质的能力，同时也形成了特殊的生活环境，使得内生菌的分离难度较大。本实验以传统的药用植物三七为研究对象，成功分离三七内生菌，对所得内生菌发酵液中的皂苷进行萃取后，筛选出可产皂苷的菌株，并对该内生菌产皂苷的发酵条件进行优化。通过内生菌发酵液提取皂苷，是实现内生菌代替药用植物的前提，能有效地解决我国某些珍稀药用植物生长缓慢和资源缺乏等问题，对三七皂苷的实际生产和应用具有一定的意义[10]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

三七鲜种子和根，购于云南省文山市。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

马铃薯培养基：马铃薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

淀粉培养基：可溶性淀粉10 g，硫酸铵2 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁1 g，氯化钠1 g，碳酸钙3 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.1.2试剂与仪器

主要试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙、乙醇、石油醚、正丁醇、齐墩果酸、香草醛、浓硫酸。

主要仪器：5048R高速冷冻离心机，德国艾本德公司；UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；1248UN超声破碎仪，清华紫光股份有限公司。

1.2方法

1.2.1三七内生菌的分离纯化

取新鲜的三七种子，流水冲洗半小时后用升汞进行表面消毒后，在无菌条件下，将种子去皮分别放于牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、淀粉培养基中于28 ℃培养箱中培养。为了保证分离的菌株是内生菌，必须对消毒效果进行检查。检查方法一是将消过毒的三七种子表面印迹于3种培养基上，置于相同条件下培养[11]；二是将最后一次冲洗种子的无菌水取适量涂于3种培养基表面，置于相同条件下培养[12]。

1.2.2内生菌发酵液中皂苷的提取

将发酵液浓缩后进行超声破碎。向浓缩的发酵液中加入95%乙醇，使乙醇的终体积分数为80%，静置24 h。8 000 r/min离心，保留上清液，之后在60 ℃水浴锅中加热成膏状，加入两倍体积的水。用等体积石油醚除去色素等脂类物质，除脂后的水溶液再加入等体积的水饱和正丁醇进行萃取[13]。

1.2.3菌株发酵液中皂苷的TLC检测

用微量移液器分别吸取定量的皂苷提取液点样于硅胶薄层板上，以皂苷Re、Rg1、Rb1为标准品作对照，用正丁醇萃取过的培养基为空白对照；将点好样的薄层板放入层析缸中的展开剂内，展开剂为氯仿-甲醇-水(体积比7∶3∶0.5)4 ℃ 静置12 h的下层溶液；显色剂为10%硫酸溶液，于105 ℃加热3～5 min显色[14]。

1.2.4分光光度计法测定皂苷含量

1.2.4.1标准曲线的绘制

精密称取Re皂苷标准品10 mg于25 mL容量瓶中，用甲醛定容摇匀。精取该溶液20，40，60，80，100 μL，分别置于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，加入新配置的8%的香草醛-乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸溶液5.0 mL，混匀闭塞后置于60 ℃恒温水浴锅中加热10 min，立即用冰水冷却10 min，摇匀，在560 nm处测吸光度[15-16]。绘制标准曲线，得回归方程：y=0.867 5x+0.018 4，R2=0.991 5。

1.2.4.2样品中皂苷含量的测定

取1 mL皂苷提取液分别置于10 mL具塞试管中，各3份，按照“1.2.4.1”的方法显色测定吸光度，由回归方程计算皂苷的含量，并计算平均值。

1.2.5菌种的鉴定

对内生菌N3进行生理生化鉴定以及DNA提取，由宝生物工程有限公司测序，将测得序列通过BLAST进行同源性比较，并采用MEGA 5.1构建系统发育树。

1.2.6不同因素对菌种生长的影响

1.2.6.1不同碳源对菌种生长的影响

以牛肉膏蛋白胨培养基培养的OD600=1.0的菌种作为种子液，按5%的接种量分别接种于以10 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和玉米粉为碳源的培养基中[17]，氮源为5 g/L的牛肉膏，无机盐为5 g/L氯化钠，在160 r/min、28 ℃的条件下培养3 d。测定内生菌发酵液的菌体密度和皂苷含量。

1.2.6.2不同氮源对菌种生长的影响

分别以5 g/L牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、硫酸铵为氮源[18]，以10 g/L蔗糖为碳源，以5 g/L 氯化钠为无机盐，其他培养条件相同的情况下，测定内生菌发酵液的菌体密度和皂苷含量。

1.2.6.3不同pH对菌种生长的影响

以10 g/L的蔗糖为碳源，以5 g/L的牛肉膏为氮源，以5 g/L氯化钠为无机盐，将培养基的初始pH分别调为6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，其他培养条件相同的情况下，测定内生菌发酵液的菌体密度和皂苷含量。

1.2.6.4不同温度对菌种生长的影响

以10 g/L的蔗糖为碳源，以5 g/L的牛肉膏为氮源，以5 g/L氯化钠为无机盐，分别在23，25，28，30，33 ℃的摇床中培养，在其他培养条件相同的情况下，测定内生菌发酵液的菌体密度和皂苷含量。

2结果分析

2.1内生菌菌种的分离纯化与菌种鉴定

采取不同的培养基对三七内生菌进行分离培养，共获得11株内生菌。将内生菌发酵液中的皂苷经正丁醇等有机溶剂提取后，进行TLC检测，实验结果如图1所示。由图1可以看出，N3样品显色后呈现浅粉色条带。由于皂苷经薄层板显色为红色或浅粉色，可以初步断定活性物质为皂苷，并将此菌株命名为N3。

图1　三七内生菌N3发酵液中皂苷的TLC图谱

对菌株N3进行16S rDNA鉴定。以菌株N3的16S rDNA序列构建系统发育树如图2所示。由图2可知，内生菌N3与E.aerogenesNBRC 13534同源性较高，初步鉴定为肠杆菌属(Enterobacter)。

图2根据菌种N3及其相关菌种16S rDNA序列同源性建立的系统发育树

Fig.2Thephylogenetictreebasedonthe16SrDNAsequencesofstrainN3andrelatedstrains

2.2不同因素对内生菌株生长和皂苷含量的影响

2.2.1碳源

由图3可知，以葡萄糖为碳源的发酵液菌体密度最大，以蔗糖为碳源的皂苷含量最高，而以蔗糖为碳源与以葡萄糖为碳源的发酵液菌体密度相差不大，说明以蔗糖为碳源更有利于内生菌株N3的皂苷合成，从而选择蔗糖为最佳碳源。

图3　碳源对菌N3生长和生成皂苷的影响

2.2.2氮源

由图4可知，以蛋白胨为氮源的发酵液菌体密度最大，以牛肉膏为氮源的发酵液皂苷含量最高，以蛋白胨为氮源的次之。可见，牛肉膏有利于内生菌株N3产皂苷，选择牛肉膏为最适氮源。

图4　氮源对菌N3生长和生成皂苷的影响

2.2.3初始pH

由图5可知，当初始pH为7时发酵液的菌体密度和皂苷含量达到最大值；随着初始pH的增大，发酵液的菌体密度和皂苷含量也随着降低，因此，选择最适初始pH为7。

图5　pH对菌N3生长和生成皂苷的影响

2.2.4温度

由图6可知，内生菌N3发酵液的菌体密度和皂苷含量随着温度的升高而增加，当温度达到28 ℃时，菌体密度和皂苷含量达到最大值；随着温度的继续升高，菌体密度和皂苷含量降低，因此，培养温度为28 ℃时有利于内生菌株N3的生长和皂苷产生。

图6　温度对菌N3生长和生成皂苷的影响

3结论

内生菌与植物共同经过漫长的进化过程，基因中含有与寄主植物相似的部分，使得内生菌具有可产生与植物相同的活性物质的能力。目前对内生菌的研究主要集中在内生菌对宿主植物的作用，而利用植物内生菌特别是药用植物内生菌生产活性物质的研究报道较少[20]。

本研究从三七植物组织中成功分离了11株内生菌，其中一株经鉴定为Enterobacter属的内生菌，EnterobacterN3可产皂苷，该菌以蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源，在pH7、28 ℃条件下更有利于合成皂苷。通过对三七内生菌的分离以及对内生菌代谢产皂苷条件的初步探索，为下一步三七皂苷的实际生产和应用提供了充实的理论基础。

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Isolation of endophytes fromPanaxnotoginsengfor saponin production and optimization of its fermentation conditions

LIUYing,HOUYingmin,SUNYebing,ZHANGZongshen,JINZhaoxia

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Eleven strains of endophytes were isolated from the seeds and roots of Panax notoginseng. One strain designated as N3 was proved to have the potential of producing sapoins in fermentation liquid. Strain N3 was identified as the genus Enterobacter based on its physiological-biochemical characteristic and 16S rDNA gene sequence analysis. Saponins could be synthesized with glucose and beef extract as the best carbon and nitrogen source respectively at pH 7.0 and 28 ℃.

Key words:Panax notoginseng; endophytes; saponins; fermentation condition

作者简介:刘 莹(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：金朝霞(1972-)，女，副教授.

收稿日期:2014-12-25.

中图分类号:TS201.2；Q939.97

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)01-0015-04