一次性完成结核分枝杆菌鉴定与利福平耐药突变基因检测的新方法

孟繁荣 牛 群 雷 杰 刘炜雯 谭守勇 刘志辉

一次性完成结核分枝杆菌鉴定与利福平耐药突变基因检测的新方法

孟繁荣 牛 群 雷 杰 刘炜雯 谭守勇 刘志辉

目的建立一种可同时进行结核分枝杆菌鉴定并检测结核分枝杆菌利福平耐药突变基因的分子方法。方法以“TGTTCTTCAAGGAGAAGCG”、“TCGTCGGCGGTCAGGTA”为上下游引物对101株结核分枝杆菌复合群及52株非结核分枝杆菌临床分离株进行rpoB基因扩增及序列测定，并应用BLAST数据库和DNAMAN软件进行菌种与rpoB基因突变分析。结果在153例分枝杆菌临床分离株中，104例鉴定为结核分枝杆菌复合群，49例被鉴定为非结核分枝杆菌，与16SrDNA基因序列鉴定方法符合率为96.73%，与传统分枝杆菌菌种鉴定方法符合率为83%;在104例鉴定为结核分枝杆菌复合群菌株中，54例被检测到rpoB基因突变，与比例法检测利福平耐药表型的符合率为96.15%。结论应用本引物进行rpoB基因序列分析可以一次性完成结核分枝杆菌鉴定与利福平耐药突变基因检测工作，有较大的临床应用价值。

菌种鉴定;序列分析;利福平耐药

【Author's address】 Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou，510095，China

耐多药结核病(MDR-TB)是结核病控制与临床诊疗中的难题。目前其诊断主要依据临床分离菌株的抗结核药物敏感性结果，实验过程包括分枝杆菌分离培养、菌种鉴定和结核分枝杆菌药物敏感性试验，过程繁琐，耗时长，即便是目前较为快速先进的MGIT960也需4周左右，难以满足临床早期诊断的需求。涂片染色抗酸菌检查简便、快速，但不能鉴别分枝杆菌菌种和指示细菌耐药性，不能诊断MDR-TB。现代分子生物学技术的发展与应用为结核杆菌耐药性判断带来了更多选择，在方法学上可实现快速的要求。研究显示:90%以上的RPF耐药结核分枝杆菌对INH同时表现耐药，说明RFP耐药性测定是MDR-TB诊断的良好标志物［1-3］。而高达95%以上的耐RFP结核分枝杆菌的分子机制是由于编码 RNA聚合酶 β亚基(RNA Polymerase B，rpoB)的基因某个特定区域的突变［4-5］。亦有报道指出:不同分枝杆菌具有各自不同的rpoB基因序列，对其基因序列进行分析可将分枝杆菌鉴定至种的水平［6-8］。因此，有望通过对rpoB基因特定序列的分析一次性完成对结核分枝杆菌的鉴定和RFP耐药性检测，从而实现对MDR-TB的快速、准确诊断。本研究即是对此进行一些尝试，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

1.1.1 标准株 来源于广州地区分枝杆菌菌种保藏库，共9株，分别为:结核H37Rv(ATCC27294)、耻垢分枝杆菌(ATCC19420)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)、胞内分枝杆菌(ATCC13950)、鸟分枝杆菌(ATCC25291)、龟分枝杆菌(ATCC35749)、不产色分枝杆菌(ATCC19530)、瘰疬分枝杆菌(ATCC19981)、爱知分枝杆菌(ATCC27280)。

1.1.2 153株分枝杆菌临床分离株均取自于我院“广州地区分枝杆菌菌种保藏库”，包括结核分枝杆菌96株、鸟胞内分枝杆菌复合群21株、龟脓肿分枝杆菌复合群11株、牛分枝杆菌5株、偶然分枝杆菌5株、耻垢分枝杆菌2株、次要分枝杆菌1株、戈登分枝杆菌1株、海鱼分枝杆菌1株、溃疡分枝杆菌1株、瘰疬分枝杆菌1株、玛尔摩分枝杆菌2株、嗜血分枝杆菌2株、兔分枝杆菌1株、亚洲分枝杆菌1株、猿分枝杆菌2株。

1.2 主要试剂仪器

通用基因组小量抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，琼脂糖粉(Gene公司)，Goldview核酸染料(鼎国昌盛生物技术有限公司)，PCR扩增仪(BIO RAD公司C1000TM Thermol Cycle系列)，电泳槽(BIO RAD公司PowerPac系列)，凝胶成像系统(BIO RAD公司Gel DocTM XR+)

1.3 rpoB基因、16SrDNA基因扩增及测序

1.3.1 引物设计

分枝杆菌rpoB基因扩增引物是在利用DNAMAN软件比对了已知各种分枝杆菌rpoB基因序列的基础上，在各分枝杆菌相同的序列区设计，扩增出的目的片段应包含 rpoB耐药决定区序列，如下: rpoBF-5’TGTTCTTCAAGGAGAAGCG3’;rpoBR-5’TCGTCGGCGGTCAGGTA3’，扩增片段长度为709-715bp，由英潍捷基生物技术有限公司合成;16SrDNA扩增引物直接引用自文献报道［9］，由英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.3.2 基因组DNA的提取 依照试剂盒说明书。

1.3.3 基因扩增

总反应体系为50μL，包括:10×PCR缓冲液5μL、dNTP(各2.5mmol/L)4μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板3μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和去离子水33.5μL;PCR反应条件:95℃预变性5min后，进入循环95℃变性30 s，56℃(16SrDNA为53℃)退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃延伸5min。取4μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检查结果。PCR扩增产物送英潍捷基生物技术公司测序，测序引物同PCR扩增引物。

1.4 数据处理

所有标本rpoB基因、16SrDNA测序结果利用美国PubMed网站“局部序列比对基本检索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)”比对分析，“Max score”“Total score”“Query cover”值最大，“E value”值为“0”，“Ident”值为100%者对应的菌种为最终鉴定结果。对鉴定为结核分枝杆菌的序列同时利用DNAMAN软件与结核分枝杆菌HRv37标准株rpoB基因序列比对。

1.5 统计学方法

以16SrDNA基因序列测定方法为标准，计算新方法的菌种鉴定结果与之符合率;以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为标准，计算新方法的菌种鉴定结果与之符合率;以利福平药物敏感性比例法检测方法为标准，计算新方法对利福平药物敏感性判定结果与其符合率。

2 结果

2.1 rpoB、16SrDNA基因扩增和测序结果

153株结核分支杆菌复合群与非结核分支杆菌均成功提取基因组DNA，并扩增得到长度分别在709～715、570～580 bp的 rpoB、16SrDNA基因片段，见图1。与此同时，对rpoB、16SrDNA基因扩增产物进行了DNA测序，测序图例见图2。

图2 扩增产物测序结果图例

2.2 菌种鉴定结果

153例分枝杆菌临床分离株中，经rpoB基因分析后，104例为结核分枝杆菌复合群，14例为胞内分枝杆菌，12例为脓肿分枝杆菌，4例为偶然分枝杆菌，1例为亚洲分枝杆菌，7例为Mycobacteirum Colombiense分枝杆菌，3例为鸟分枝杆菌，3例为Parascrofulaceum分枝杆菌，1例为 Sinense分枝杆菌，1例triplex分枝杆菌，1例为Vulneris分枝杆菌，1例被鉴定为Septicum或Vulneris，1例不能鉴定菌种，以16SrDNA基因序列鉴定方法为标准，其鉴定准确率为96.73%;以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为标准，其鉴定准确率为83%。

2.3 利福平耐药基因突变结果

被鉴定为结核/牛分枝杆菌的104株菌，50株无rpoB基因突变，判定为对RFP敏感;54株存在rpoB基因突变，突变位点及例数分别为:511位4例，513位1例，516位11例，526位9例，531位29例，判定为对RFP耐药。与比例法检测利福平耐药表型的符合率为96.15%。

3 讨论

本研究通过对各分枝杆菌rpoB基因序列分析，设计特异引物扩增包括第3个高可变区序列和利福平耐药基因决定区序列在内的rpoB基因片段，利用Gene Bank BLAST、DNAMAN软件进行序列分析而达到分枝杆菌菌种鉴定与利福平耐药性检测的目的。

研究对153例临床分离株中结核分枝杆菌复合群、鸟胞内复合群、龟脓肿复合群、偶然分支杆菌、亚洲分支杆菌、Colombiense分枝杆菌、Parascrofulaceum分枝杆菌、Sinense分枝杆菌的鉴定结果与具有细菌系统分类“金标准”之称的16SrDNA基因菌种鉴定的结果一致，鉴定符合率高达96.73%，说明本方法在分枝杆菌菌种鉴定方面具有较高准确性。然而除1株不能被本方法鉴定外尚有4株鉴定结果与16SrDNA基因鉴定结果不同，究其原因，可能是Gene Bank中保存的分枝杆菌rpoB基因序列种类不够全面甚至有些序列只是一些片段而导致比对中存在错漏。以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为标准，本研究可以对结核分枝杆菌复合群、鸟胞内复合群、龟脓肿复合群、偶然分枝杆菌作出准确的鉴定，满足了对临床常见非结核分枝杆菌鉴定的要求。本研究的菌种鉴定结果与传统分枝杆菌菌种鉴定方法符合率稍低，准确率为83%，除了Gene Bank本身存在的缺陷外，传统的菌种鉴定方法操作过程繁琐，影响因素多，对检验人员专业知识的高度要求及依据经验判断也是导致其鉴定结果容易出现偏差的原因。

95%以上的结核分枝杆菌对利福平耐药是因为rpoB基因507～533位的81个碱基区域的突变所导致［4-5］，而对利福平耐药的结核分枝杆菌通常也同时对异烟肼耐药，rpoB基因突变检测对于诊断耐多药结核病的重要性可见一斑。对本研究中被rpoB基因鉴定为结核/牛分枝杆菌的104株菌，同时进行rpoB基因突变性分析，其中54株被判定为对RFP耐药，50株判定为对RFP敏感，与比例法检测利福平耐药表型的符合率为96.15%，具有非常高的准确性。新的分子生物学方法诸如利福平耐药实时荧光定量PCR技术(Xpert MTB/RIF)可在2 h内完成临床样品的结核分枝杆菌及其利福平耐药性检测，以其较高的敏感性和特异性得到WHO的认可和推荐［10-13］。但其只能检测结核分枝杆菌复合群，对目前临床日渐上升的非结核分枝杆菌无检测能力。而本研究则做到了在鉴定分枝杆菌菌种的同时完成利福平耐药基因的检测。

综上所述，本研究方法可以准确区分结核与非结核分枝杆菌，虽然对非结核分枝杆菌某些菌种的鉴定存在不确定性，但对临床常见的非结核分枝杆菌菌种具有良好的鉴别，特别是对广州市临床分离株中非结核分枝杆菌构成比在前4位［14］的龟脓肿分枝杆菌复合群，鸟胞内分枝杆菌复合群、偶然分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌有良好区分，并可同时准确检测rpoB基因突变判断结核分枝杆菌对利福平耐药性，从而为MDR-TB的诊断提供一定参考。然而本研究中选用的分枝杆菌参考菌株数量有限，仅9种，本方法是否对现有一百多种分枝杆菌均有良好的扩增能力及鉴别能力仍值得我们做进一步验证。

同时，鉴于痰涂片抗酸染色检查的快捷方便性，对于没有条件完成基因扩增与序列测定的基层医疗单位，可以考虑将痰涂片送至高级实验室进行检测。那么，利用本研究引物直接从痰涂片标本中扩增特定rpoB基因片段同时完成分枝杆菌菌种鉴定与利福平耐药性检测，将是我们进一步努力的方向。

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An Innovative Method for Identificatng Mycobacterium Tuberculosis and Indicating It's Rifampin Resistance Simultaneously

MENG Fanrong，NIU Qun，LEI Jie，et al

ObjectiveTo establish a new method for identification of mycobacteria tuberculosis and rpoB gene mutation of rifampicin resistance.MethodsA pair of specific primer for amplification of the third hypervariable region and rifampicin resistance determining region in Mycobacterium genome was designed.The rpoB gene segment of96 mycobacterium tuberculosis complex strains and57 nontuberculosis mycobacteria was amplified and sequenced used by this specific primer and all of the gene sequences were analyzed by BLAST and DNAMAN software.ResultsAmong the153 clinical isolates，one hundred and four were identified as mycobacterium tuberculosis complex and49 as nontuberculosis mycobacteria，including14 mycobacterium intracellular，12 mycobacterium abscessus，4 mycobacterium fortuitum，1 mycobacterium asiaticum，7 mycobacterium colombiense，3 mycobacterium avium，3 mycobacterium parascrofulaceum，1 mycobacterium sinense，1 mycobacterium triplex，1 mycobacterium vulneris and1 mycobacterium septicum/vulneris.One case could not be identified.Compared with the16SrDNA gene，the accuracy rate of this new method was96.73%;Compared with the traditional method，its accuracy rate was83%.In104 cases identified as mycobacterium tuberculosis complex，there were54 cases detected rpoB gene mutation which was determined resistant to RFP while50 cases had no mutation and determined sensitive to RFP.Compared with traditional drug sensitivity test，the accurate rate of this new method was96.15%.ConclusionThis new method is very useful because it can be identification of common mycobacterium species and detection the rifampin resistant through rpoB gene sequence analysis by only one test.

Strain Identification;Sequential Analysis;Rifampicin Resistance

R446.7;R378.91+1

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.002

广东省科技计划项目(编号:2011B061300085);广东省科技计划项目(编号:2011B031800377);广州市医药卫生科技项目(编号:20151A011036);广州市科技计划项目(编号:155700012)

孟繁荣 牛 群 雷 杰 刘炜雯 谭守勇 刘志辉:广州市胸科医院 广东广州 510095

刘志辉