HPLC-ELSD法同时测定桔梗中5种皂苷含量

岳　虹，陈芙蓉，王梦丽，谢红英，冯亚男，徐小平

（四川大学华西药学院，四川成都610041）



HPLC-ELSD法同时测定桔梗中5种皂苷含量

岳虹，陈芙蓉，王梦丽，谢红英，冯亚男，徐小平

（四川大学华西药学院，四川成都610041）

摘要：建立高效液相色谱法同时测定桔梗药材中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的方法。色谱柱为ODS 250 mm×4.6 mm×5μm，流动相A为乙腈-0.2%甲酸，流动相B为水，采用梯度洗脱（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。供试品经50%甲醇（ν/ν）超声提取30min，过滤蒸干后以50%甲醇（ν/ν）定容至5mL容量瓶中；漂移管温度为75℃，氮气流量为2.5L/min。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D分别在0.64～6.4μg、1.22～12.2μg、1.08～10.8μg、0.74～7.4μg，1.7～17μg范围内组分浓度与峰面积线性关系良好；药材中5种成分的平均加标回收率分别为101.1%、99.9%、100.4%、100.7%和101.6%；RSD均＜5%。该方法简便、准确，分离效果好，可用于桔梗药材的质量控制。关键词：桔梗；桔梗皂苷；HPLC-ELSD；梯度洗脱

0　引言

桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）为桔梗科（Campanulacae）桔梗属（Platycodin）多年生草本植物[1]，广泛分布于东亚地区，我国多地区均有种植。桔梗的主要活性成分是齐墩果烷型三萜皂苷，药理研究表明桔梗皂苷具有多种活性，包括抗癌、抗氧化、抗丙肝、减肥等功能[2-3]，而对桔梗药材质量的有效控制是其发挥药效的基础。

我国幅员辽阔，桔梗药材生长环境差异大，导致其质量良莠不齐，有效成分含量变化大，有必要加强其质量控制以保证药效[4-5]。桔梗中皂苷成分结构复杂，活性多样，而在《中国药典》2010版中仅对桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）设定了含量限度[6]，不能更全面地反映药效和控制桔梗药材质量。本文通过对不同产地桔梗中去芹糖桔梗皂苷E（deapioplatycoside E）、桔梗皂苷E（platycoside E）、桔梗皂苷D3（platycodin D3）、去芹糖桔梗皂苷D（deapioplatycodin D）及桔梗皂苷D（platycodin D）5种桔梗皂苷成分进行测定，建立了桔梗皂苷HPLC-ELSD含量测定方法，为桔梗药材质量控制提供参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

LC-100高效液相色谱仪（上海伍丰仪器公司）；ELSD-UM 5000蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；N2000数据采集软件（浙江大学）；MS105DU电子天平（瑞士梅特勒托利多仪器公司）；LEO-801超声清洗器（昆山超声设备有限公司）。

1.2试药与样品

桔梗药材样品分别购自山东、安徽、甘肃、四川、及河北等桔梗产区（见表7），均为桔梗科植物桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）的根。桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3对照品均为实验室自制，经HPLC面积归一化法测定纯度高于98%；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱Promasil C18（250mm×4.6mm×5μm），柱温30℃；流动相A为乙腈-0.2%甲酸，流动相B为水，梯度洗脱（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。流量1.0mL/min；进样量20 μL；ELSD检测器检测参数：漂移管温度75℃，载气（N2）流量2.5 L/min。色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备

精密称取对照品去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D适量，加50%甲醇制成每1mL分别含有去芹糖桔梗皂苷E 0.32mg、桔梗皂苷E 0.61mg、桔梗皂苷D30.54mg、去芹糖桔梗皂苷D 0.37mg、桔梗皂苷D 0.85 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取桔梗样品2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定质量，超声处理30min，取出，常温冷却，再称定质量，用50%甲醇补足损失质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25mL，在60℃下减压蒸干，残渣加少量50%甲醇转移至5mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

图1　桔梗药材和5种皂苷对照品的HPLC-ELSD谱图

2.4供试品溶液的制备方法优化

2.4.1提取溶剂的考察

取桔梗药材粉末（批号20130615，产地安徽亳州）（过5#号筛）3份，各2.0g，精密称定，分别精密加入甲醇、50%甲醇和水50mL，每份称3个平行样，按照2.3供试品的制备方法进行制备，测定供试品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，结果显示，50%甲醇提取的5种桔梗皂苷含量高于甲醇和水，因此选择50%甲醇作为提取溶剂。

2.4.2提取方式的考察

取桔梗药材粉末（批号20130615，产地安徽亳州）（过5#号筛）4份，各2.0 g，精密称定，精密加入50%甲醇50mL，称定质量，分别超声处理15min、30min、1h，回流提取2 h，按照2.3供试品的制备方法进行制备，测定供试品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，结果见表1。由表可知，在超声30min后，5种桔梗皂苷已基本提取完全，且超声30min与回流2h效果相当。为操作简便，采用超声30min作为提取方式。

表1　不同提取方式对桔梗皂苷提取的影响

2.4.3料液比的考察

取桔梗药材粉末（批号20130615，产地安徽亳州）（过5#号筛）4份，各2.0 g，精密称定，分别加入50%甲醇30，40，50，60mL，称定质量，超声30min后，按照2.3供试品的制备方法进行制备，测定供试品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，如表2所示。结果表明在其他提取条件一致的情况下，料液比为1：25时桔梗皂苷提取较为彻底，因此选择提取料液比为1：25。

表2　不同提取料液比的考察

2.4.4提取次数的考察

取桔梗药材粉末（批号20130615，产地安徽亳州）（过5#号筛）3份，各2.0 g，精密称定，分别加入50%甲醇50 mL，称定质量，对3份供试品分别提取1，2，3次，分别合并2次和3次提取液，按照供试品的制备方法测定供试品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，结果显示在其他提取条件一致的情况下，提取1次已经基本将供试品中5种皂苷成分提取出，因此选择提取次数为1次。

2.5线性范围考察

精密吸取2.2项下对照品混合溶液2，4，8，12，16，20μL，分别注入液相色谱仪进行测定，以峰面积的自然对数（y）对进样量的自然对数（x）进行线性回归，得回归方程，结果见表3，表明各成分在相应范围内，进样量与峰面积呈现良好的线性关系。

表3　桔梗皂苷的线性关系考察

2.6进样精密度

精密吸取混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定各成分峰面积的自然对数值并计算RSD。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分别为1.2%，2.3%，2.8%，3.4%，0.9%，结果表明仪器的精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一对照品溶液，分别于0，4，10，24，28，30h注入液相色谱仪，测定各成分峰面积的自然对数值并计算RSD值。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分别为1.8%，1.3%，2.1%，1.4%，1.9%，结果表明对照品溶液在30h稳定性良好。

2.8重复性试验

取同一批次桔梗药材（批号20130615，产地安徽亳州），平行制备6份供试品溶液，按照2.3供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，按照上述色谱条件进行HPLC分析。根据所测峰面积的自然对数计算各成分在样品中的含量。结果表明去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的平均含量分别为0.06%，0.23%，0.21%，0.08%，0.31%，RSD分别为1.2%，2.2%，1.6%，1.0%，1.8%，该方法重复性较好。

2.9加标回收率试验

表4　桔梗皂苷平均加标回收试验（n=6）

取已知含量的桔梗药材粉末适量，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D对照品适量，按照2.3供试品制备方法操作，制备6份加标供试品溶液。吸取加标供试品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各成分平均含量。根据测得量和加入量，计算各待测成分的回收率，结果见表4。

2.10样品测定

取不同产地的桔梗药材，按照2.3供试品制备方法制备供试品溶液，测定样品中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，平行测定3次，结果如表5所示。

表5　不同产地桔梗药材的测定结果（n=3）%

3　讨论

桔梗的主要成分是三萜皂苷，这一类型化合物结构缺乏强紫外吸收的生色团，仅在苷元C12-C13位置上具有单一双键，使其在210nm附近具有紫外吸收，该波长范围为溶剂末端吸收区，易产生溶剂干扰和基线的不稳定，从而对样品的测定产生干扰，造成测定结果不准确。而采用蒸发光散射检测器则因成分对激光光源发生散射产生信号进行测定，避免了紫外吸收干扰，从而适用于皂苷类弱紫外吸收成分的测定[7-9]。

在《中国药典》2010年版中有关桔梗含量测定项下采用的色谱条件是25%乙腈等度洗脱，但在色谱条件下需要对样品进行复杂的前处理才能取得较为理想的分离度。为此，本试验采用梯度洗脱的方式可更有效地同时分离混合样品中的各个组份，同时简化了样品前处理步骤，缩短了分析时间，提高工作效率。

通过对不同产地10批次的桔梗药材进行含量测定，结果表明去芹糖桔梗皂苷D和桔梗皂苷D是桔梗药材中的主要皂苷成分，且这两种成分在不同产地的桔梗药材中的含量都较为稳定。另外，有研究表明去芹糖桔梗皂苷D具有多种药理活性[10-12]。因此，除药典原有的桔梗皂苷D以外，提示去芹糖桔梗皂苷D可成为桔梗药材质量标准的待选指标，以便提高药材的质量控制标准。

4　结束语

本方法操作简便，定量准确，实现同时测定桔梗药材中5种桔梗皂苷的含量，可应用于桔梗药材的质量控制。

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（编辑：徐柳）

Simultaneous determination of the content of 5 Platycosides in Platycodon radix

YUE Hong，CHEN Furong，WANG Mengli，XIE Hongying，FENG Ya’nan，XU Xiaoping
（West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Abstract:Simultaneously determination of the 5 platycosides in Platycodon radix with HPLC-ELSD method. Gradient elution（0-15min，20%-22%A；15-60 min，22%A；60-65 min，22%-30%A；65-70 min，30%-20%A）is carried out under the following conditions: ODS 250 silica gel as solid phase（250mm×4.6mm×5μm），acetonitrile -0.2% methanoic acid as mobile phase A，and water as mobile phase B；the test products are ultrasonically extracted with 50% methanol（ν/ν）for 30 min，filtered and dried by distillation before further dilution with 50% methanol（ν/ν）to a 5mL volumetric flask；and the drift tube is set at 75℃and the nitrogen flow rate 2.5 L/min. The compositionconcentrationshows agoodlinear relationshipwiththepeakareawhen deapioplatycoside E，platycoside E，platycodin D3，deapioplatycodin D and platycodin D are 0.64-6.4 μg，1.22-12.2 μg，1.08-10.8 μg，0.74-7.4 μg and 1.7-17 μg respectively. The average recoveries of the five ingredients are 101.1%，99.9%，100.4%，100.7% and 101.6% respectively. All the RSDs are lower than 5%. The method is simple，accurate and efficient，suitable for the quality control of Platycodonradix.

Keywords:Platycodon radix；Platycoside；HPLC-ELSD；gradient elution

通讯作者：徐小平（1962-），男，四川宜宾市人，副教授，硕士，主要从事药品质量控制研究。

作者简介：岳虹（1981-），女，四川成都市人，硕士研究生，专业方向为药物分析。

收稿日期：2015-07-12；收到修改稿日期：2015-09-10

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.01.012

文献标志码：A

文章编号：1674-5124（2016）01-0049-04