哈尼族药铜锤白花片的质量标准

付开聪　崔明筠　周兵

【摘 要】 目的：建立哈尼药铜锤白花片的质量标准。方法：采用薄层色谱法（TLC）定性鉴别三七、独活和白芍，采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中龙血素b的含量。结果：TLC法能定性检出三七、独活和白芍，斑点清晰，且阴性对照无干扰；HPLC法测定龙血素b，进样量在0.031～0.157μg，龙血素b峰面积与进样量呈现良好的线性关系（R2=0.998），平均回收率98.42%（RSD 0.82%）。结论：所建标准简便可行，稳定性好，可用于哈尼族药铜锤白花片的质量控制。

【关键词】 铜锤白花片；薄层色谱法；高效液相色谱法；龙血素b

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0019-02

铜锤白花片来源于云南哈尼族民间，主要用于治疗治腰椎间盘突出症、腰椎间盘突出症引起的腰腿疼痛等症状，本方在普洱市民族医院临床使用多年，疗效显著。该方由铜锤草、白花丹、龙血竭和三七等十九味药组成，临床上以汤药使用，为方便患者储存、携带和服用，将其剂型改为片剂。为建立其质量标准，保证临床疗效，采用薄层色谱法鉴别方中的三七、独活和白芍，高效液相色谱法测定方中的有效成分龙血素b，为铜锤白花片的质量控制提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 1525 HPLC 仪（美国Waters公司）；KQ250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AG135十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Scanner-3薄层色谱扫描仪（瑞士CAMAG公司）。

1.2 试药 铜锤白花片（规格0.5g/片，北京师范大学制备，批号20140815，20140816，20140817）；龙血素b（批号111558-201407）；人参皂苷R1（批号110703-200424）；芍药苷（批号110736-201438）；独活对照药材（批号1200940-201111）；均购于中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯；水为纯净水；其他试剂均为分析纯；硅胶板（青岛海洋化工厂分厂）。

2 方法与结果

2.1 铜锤白花片的制备 将铜锤草、三七、龙血竭、蜈蚣等药材粉碎成细粉，备用，白花丹、独活、牛膝、桂枝、灯盏花、当归、白芍等药材加水煮提三次，第一次加10倍量水浸泡2h，煮沸2h，第二次加8倍量水，煮沸1h，第三次加8倍量水，煮沸1h，合并滤液，浓缩成稠膏状后加入备用细粉搅拌均匀，制粒，整粒，压片，即得。

2.2 薄层色谱鉴别[1-3]

2.2.1 三七的鉴别 取铜锤白花片5g，研碎，粉末加乙醇50ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml乙醇溶解，作为供试品溶液；再取人参皂苷R1对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；按供试品制备方法制得缺少三七样品的阴性液；吸取上述溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上。分液漏斗中加入三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合溶液，比例为7.5∶20∶11∶5，置10 ℃以下放置，取下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液为显色剂，在105℃加热至斑点显色清晰。置紫外光灯（365nm）下检视，铜锤白花片供试品与人参皂苷R1对照品在薄层板相应的位置上，显相同的荧光斑点。见图1。

2.2.2 独活的鉴别 取铜锤白花片5g，研碎，粉末加乙酸乙酯50ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml乙酸乙酯溶解，备用；取独活对照药材加甲醇25ml，超声30min，滤过，滤液浓缩至1ml的溶液，作为对照品溶液；按铜锤白花片供试品制备方法制得缺少独活样品的阴性液；吸取上述溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯（2∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外光灯（365nm）下检视。铜锤白花片供试品与对照药材在薄层板相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

2.2.3 白芍的鉴别 取铜锤白花片5g，研碎，粉末加甲醇5ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；对照品溶液取适量芍药苷，加甲醇制成1ml含1mg芍药苷的溶液；除去白芍样品，按铜锤白花片供试品制备方法制得的阴性液；吸取上述溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.4）为展开剂，展开，取出，晾干， 5%香草醛硫酸溶液为显色剂，加热至斑点显色清晰。铜锤白花片供试品与对芍药苷在薄层板相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图3。

2.3 龙血素b含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验[4-8] 色谱柱为 Waters XTerra@RP18 C18柱（3.9mm×150mm， 5μm）；乙腈-1%乙酸水溶液（37∶63）；检测波长275nm，流速1.0ml·min-1，柱温：30℃，进样量10μl。理论塔板数按龙血素b峰计算不低于10000。

2.3.2 对照品溶液的制备 取对照品龙血素b10.48mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀， 精密量取适量，加甲醇稀释成10.48μg·ml-1的溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）3.5g，精密称定，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声提取30min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性液的制备 按处方比例称取除去龙血竭的其他药材适量，依照铜锤白花片的制备工艺制得阴性样品，照“2.3.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3.5 线性关系的考察 自动精密吸取“2.3.2”项下的龙血素b对照品溶液3、5、8、10、13、15μl，按色谱条件测定样品溶液中龙血素b的含量，以龙血素b对照品溶液的进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=40721X-13550，R2=0.998。结果表明， 龙血素b进样量在0.031～0.157μg，龙血素b峰面积与进样量呈现良好的线性关系。

2.3.6 精密度试验 取“2.3.2”项下的龙血素b对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定，记录峰面积。结果RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验 取6份样品（批号：20140815），分别按色谱条件操作，测定龙血素b含量。结果龙血素b的含量均值为254.75μg·ml-1，RSD为1.42%，表明本方法重复性好。

2.3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20140815测定）， 按0、2、4、6、8、12h时间间隔，分别测定龙血素b峰面积。结果，RSD为1.87%，供试品溶液制备后12 h内测定，色谱峰面积无明显变化，在此时间内测定铜锤白花片样品溶液，化学性质稳定。

2.3.9 加样回收试验 取已知准确含量的铜锤白花片样品（批号：20140815），精密称定，加入浓度为0.1048mg·ml-1的龙血素b对照品溶液4.3ml，定容至100ml， 称定重量，超声提取30min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按色谱条件操作， 测定龙血素b含量。结果见表1。

2.3.10 样品测定 取 3批铜锤白花片适量，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算样品中龙血素b的含量分别为0.1750、0.182、0.183mg/片。

3 讨论

铜锤白花片为云南省普洱市哈尼族的传统药方，具有治疗治腰椎间盘突出症、腰椎间盘膨出症引起的腰腿疼痛症状的功效，有丰富的临床使用数据，使用年限超过10年。为了更好的服务患者，保护民族民间医药，传承民族医药文化，普洱市民族医院对铜锤白花片进行质量控制研究。

根据有关文献报道、临床服用方式、以及疗效数据显示，提取过程采取了加水煎煮的提取工艺[9-10]；方中三七、独活、白芍采用TLC 法鉴别，简便，快速，且无阴性干扰。通过紫外分光光度法对龙血素b对照品溶液在200～400nm波长进行扫描，结果发现其最大吸收波长为275nm，峰形佳，因此确定采用275nm作为检测波长；实验过程中采用乙腈-1%乙酸水溶液（37∶63）作为流动相，理论塔板数63411，同时计算龙血素b与相邻峰的分离度为2.9，符合定量分析要求；试验所建标准可用于哈尼族药铜锤白花片的质量控制依据。

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（收稿日期：2015.12.28）