高效液相色谱法检测食品中大豆蛋白方法研究

□ 潘仲乐　黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

高效液相色谱法检测食品中大豆蛋白方法研究

□ 潘仲乐黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

大豆是我国传统食物,在许多东南亚国家的饮食结构中占有十分重要的地位。近些年,随着对大豆食品的深入研究，大豆异蛋白保健功能越来越受到大家关注。大豆蛋白的组成成分与牛奶蛋白质有一定的相似。而其在营养价值方面，甚至可以和动物蛋白等同，在基因结构上最接近人体氨基酸，所以是最具营养的植物蛋白质。因此，本文通过高效液相色谱法来研究大豆中的蛋白质。

因为大豆蛋白中隐藏着外啡肽的片段，就使大豆肽食品中可能含有外啡肽，所以对大豆肽食品进行外啡肽的检测十分有必要。采取高效液相色谱这种方法，以酪啡肽为标准进行了流动相的选择、柱压和灵敏度等条件的研究和探索，得出的检测结果是波长为220 nm，柱温为25℃。与标准品对照保留时间和面积，得出酸性蛋白酶中含有目标外啡肽。

高效液相色谱法的基本概述

高效液相色谱法又可以叫做高分离度液相色谱、高速液相色谱、高压液相色谱等。它就是在生物化学和分析高级的化学中经常用到的柱状分析仪器。而高效液相色谱是色谱法中一个非常重要的分支，将液体作为流动的相，运用高温高压的输液系统，将具有极性不同的不混合溶剂或者比例不一样的混合溶剂都一起泵入装固定相的色谱柱内。等到色谱柱里各种成分被分离完毕之后，再运用检测器对其进行细致的检测，以此来达到对试样的具体分析。这种方法可以既有效又方便地从医学、化学、工业学、农业学和法检等许多学科中得出科学研究需要的数据材料，这种方法已经成为我国重要的分离和分析技术手段。

食品中大豆蛋白的检测材料与方法

实验材料准备

实验中所需要的仪器：高效液相色谱仪器HP1100型；pHs-3c精密仪（上海雷磁仪）。色谱柱为C18柱，规格是 250 mm× 4.6mm,5μm。试验中所用水均为超纯水,试剂必须是分析纯。大豆蛋白的标准品。还需要大豆异黄酮的标准储备液体：要求精确称取标准的大豆苷元2.60 mg，染料木黄酮2.70 mg，将两者分别融入甲醇或者色谱纯内，并用甲醇固定溶液到5 mL，然后将其放入冰箱里冷冻保存。其中，大豆苷元的浓度要求为520 μg/mL,染料木黄酮的浓度要求为540 μg/mL。对于大豆异黄酮的混合使用液，用之前需要采取一定量的标准储备液，并用甲醇充分稀释。0.01 mol的乙酸铵溶液需要用冰乙酸调至pH值达到4.5才可以。对甲醇的要求为重蒸馏、抽滤而且需要用前超声波来对其脱气。

样品的测定

实验的样品经过研磨、粉碎的加工之后，将其均匀的混合，并准确地称取一定量的样品，加0.5 mol的盐酸溶液加至大约30 mL然后混匀，在沸水中加热回流3个小时，在进行冷却，接着用0.5 mol/L的盐酸溶液定容到50 mL，混匀。用一定量的水解样液，用其将乙醇溶解后定容至25 mL，然后将其摇匀。用0.3 μm的有机滤膜过滤，作为待测样品。同绘制标准曲线一样的色谱检测条件下分析待测的样品10 μL，来测试样品中大豆苷元染料木黄酮的色谱面积,以确保时间的稳定性和峰面积的定量性。

检测的选择条件

实验的样品溶液首先要通过0.5 mol/L的盐酸液对其进行回流，然后水解3个小时，这样做的原因是使样品中的大豆蛋白转变为游离的状态。随后被溶解的大豆苷元和染料木黄酮也可以进入有机的溶剂中，但它们却不能溶于水里。在酸被水解之后，就能够用甲醇或者乙醇溶中的游离状态的大豆蛋白质。笔者把这3种溶剂进行详细的对比，通过这种方式比较了解几种不同形态的食品酸水解溶液，同时也对染料木黄酮和大豆苷元的溶解情况进行细致的分析。通过分析可以发现这3者中，乙醇的提取效果是最好的。但由于在同一水解液中加入乙醇的量不相同，这会对等待测试的样品溶解有一定的不良影响。这时就需要取适量的水解溶液，在其中加入不同量的乙醇，等其溶解之后再对色谱进行详细的分析和研究。最后实验证明：当样品水解液被乙醇稀释达3倍左右时，就可以完全提取出大豆苷元和染料木黄酮这两种物质。

标准曲线的绘制

分别吸取10 μL不同浓度的大豆异黄酮混合标准使用液，并对其进行色谱分析,以甲醇-0.01 mol/L乙酸铵缓冲溶液作为流动的相,流速为每分钟1 mL，柱温尽量保持在2℃，并在254 nm的部位进行检测，测量标准溶液中大豆苷元和染料木黄酮的色谱面积。把大豆异黄酮的浓度数作为坐标轴中的横坐标,色谱峰面积作为纵坐标，以此来绘制色谱峰的标准曲线或者进一步得出线性回归方程。

实验结果的分析与讨论

样品提取的选择条件

此次实验对4种不同的食品样品进行了测试，改变了水解时盐酸的浓度。通过实验可以证明，盐酸的酸度对大豆苷元的提取作用不是很大，但对提取染料木黄酮却有着较大的影响。当盐酸的浓度比0.5 mol还要高时，染料木黄酮的所提取量就有所降低。当盐酸酸度达到0.5 mol/L，这时候对两种待测样品的提取效果都较好。水解时盐酸浓度对两种实验样品的影响，将待测食品样品在0.5 mol/L的盐水中用沸水加热，然后分别将它们水解和回流不同的时间范围控制在0.5～ 4小时。实验结果表明：回流2小时以上时，样品中大豆异黄酮已经完全水解。此次实验运用回流3小时水解，分别于40、60、80℃和沸水中回流3小时水解样品中的大豆异黄酮，结果展示出了样品中的染料木黄酮和大豆苷元含量随着温度的升高而升高。

色谱的优化条件

对流动相进行选择，对于大豆异黄酮的测定，可以采用乙腈缓冲液作为流动相，但其中乙腈的价格比较昂贵，而且毒性较大。由于甲醇具有粘度较小、柱压而且价格便宜适用范围广的优点，所以常常被用于色谱分析的流动相。这种方法利用甲醇-0.01mol的乙酸铵缓冲体系用作流动相，对其进行分离。流动相的pH值对待测的两种大豆样品的分离有所影响。用冰乙酸来调节乙酸铵，乙酸铵溶液的pH值为3~6，它们分别与甲醇的比例混合，然后作为流动的相。试验表明，当缓冲溶液的pH值达到4~6时，待测两组的样品色谱峰就会完全分离,分离的程度大于2.0。改变流动相甲醇乙酸铵pH4.5中甲醇的比例为30%～80%。对待测样品进行色谱的检测，结果表示：当流动相中的甲醇比例低于65%，这时两种物质就已经可以达到很好的分离效果。同时，考虑到了有可能受样品中杂质的影响，此实验选用的流动相，其中甲醇与0.01 mol的乙酸铵缓冲溶液混合的比例为60︰40，染料木黄酮的保留时间为9分钟，大豆苷元的保留时间分别为6分钟。对于流速和柱温的选择，流动相的流速对待测组分的分离有着直接的影响。本实验分别采用每分钟0.5~1.2 mol的流速，对待测组分进行有效的分离分析。结果显示：流速越大保留的时间越小，但柱压却随之变大，这种方法对于色谱柱有一定的损耗，流速减小的情况分析时间就会延长,且色谱峰变宽。本实验采用1.0 mol/min的流速。在15~50℃的范围内对柱温进行改变，这种实验对待测样品的分离影响并不是很大，但由于柱压和柱温的反比关系，导致色谱柱的使用寿命明显降低。因此，实验中柱温不宜过低,本法次测试是25℃。

线性范围的试验

在此次试验的色谱条件下，大豆苷元和染料木黄酮的浓度与面积之间存在着良好的线性关系。最佳的线性范围是大豆苷元在0.5~520 μg,染料木黄酮在0.5~540 μg。大豆苷元的线性回归方程为y=32.5x-1.37,而染料木黄酮为y=49.6x-4.47，用低浓度的混合标准使用液重复进行测试11次，得出色谱峰面积的3倍标准差，所对应浓度作为此方法的检出限制，而大豆苷元的检出限为0.05 μg,染料木黄酮为0.04 μg。对于这种方法的精密度采用以下方式测定，取3种浓度不一样的混合标准使用液,按照此次试验选定的色谱标准进行色谱的测定,以峰面积作为定量,计算两种待测样品的相对标准偏差。

方法准确度的试验

此次试验选定的实验条件是对3种食品样品加标回收的检测，以此来评价这种方法的准确程度。结果证明两种待测样品的回收率范围是大豆苷元94.1%~109.4%，平均的加标回收率是102%，而染料木黄酮的是91.4%~113.1%，平均加标的回收率102.6%。

两种样品分别采用超声波提取的方法和室温提取的方式，通过实验知道两种提取方法的提取效率是相同的，本实验采取了对室温提取，这样不仅可以降低能源的消耗，还可以降低检测成本。将大豆样品分别放在室温下，提取5~25分钟，每隔五分钟一次，实验结果表明15分钟以后游离氨基酸总量停止增长，所以提取时间做好为15分钟。将所配制的5种浓度的氨基酸标准混合液进行测定，以各氨基酸峰面积为纵坐标，氨基酸浓度为横坐标进行线性回归的分析来得到回归方程。各种氨基酸的浓度在每分钟5~900 mol范围内时，其才具有良好的线性关系,这时的相关系数r在0.999 1~0.999 9之间。以信噪比计算最小限制，准确地称取已测定出的游离氨基酸，其含量大豆样品有6份，分别以游离氨基酸含量的80%、100%和120%左右加入标准液，然后对样品进行提取。测得各氨基酸的回收率在96.32%~102.25%之间，相对的标准偏差为1.52%~4.30%。

样品的测定结果

本实验选定的条件分别对豆粉、豆奶、豆腐干和保健食品这4种样品进行测定,为了保证峰面积的定量和时间的定性,需要分别对这4种样品中大豆异黄酮的含量进行准确的计算。对10份大豆蛋白质样品进行游离氨基酸含量的检测,所需的样品总量为3.499~12.14 mg,平均含量为7.78 mg。9种必需氨基酸组氨酸和赖氨酸等等占总量的11.02%~25.97%。而大豆品种的不一样和同一品种的游离氨基酸含量之间存在着较大差异性，这样可以给大豆资源的保存、利用和评价提供科学的依据。10份样品氨酸的含量都不低，占总量的27.69%~71.71%，其中9个样品甚至达到40%以上，由于精氨酸有控制体内细胞的退化降低血氨和增加肌肉活力的作用,因此将大豆应用于这些具有保健功能的食品，应该可以开拓广阔的发展前景。

结语

本本研究细致地探讨了部分食品样品中大豆蛋白的检测提取方法，对调查大豆及其所生产的制品和保健食品中大豆蛋白的含量提供了有效的分析方法，为进一步研究食物雌激素大豆蛋白对人体健康的影响充分提供了实验手段。这种实验方法不仅具有线性好、范围宽的优点，检测的准确度还很高，分析时间仅需14分钟，并且样品前处理非常简单。这种高效液相色谱法适合大豆及其他食品中蛋白质含量的测定。