久泻宁颗粒治疗大鼠慢性非特异性溃疡性结肠炎的实验研究*

马少丹，赵红霞，程远棚，苑述刚，邱美榕，阮时宝

(1.福建中医药大学药学院，福州 350122;2.中国中医科学研究院中医基础理论研究所，北京 100700)

久泻宁颗粒治疗大鼠慢性非特异性溃疡性结肠炎的实验研究*

马少丹1，赵红霞2△，程远棚1，苑述刚1，邱美榕1，阮时宝1

(1.福建中医药大学药学院，福州 350122;2.中国中医科学研究院中医基础理论研究所，北京 100700)

目的:研究久泻宁颗粒对慢性溃疡性结肠炎(UC)的治疗作用并探讨其可能的作用机制。方法:以2，4-二硝基氯苯和异种异体抗原乳化液联合应用建立大鼠溃疡性结肠炎模型后，连续给药14 d，腹主动脉采血测定血清 IL-2、TNF-α、免疫球蛋白IgG、IgM以及SOD、MDA，同时截取结肠溃疡明显处做病理分析。结果:UC模型组与正常组比较差异有统计学意义，血清TNF-α、IgG、IgM水平明显升高，IL-2水平明显降低。与模型组比较，久泻宁颗粒组TNF-α、IgG、IgM、MDA水平降低，IL-2、SOD水平升高。结论:久泻宁颗粒能明显调节UC大鼠机体免疫功能异常，对UC模型大鼠结肠溃疡面有较好的修复作用。

久泻宁颗粒;溃疡性结肠炎;异种异体免疫;药效

溃疡性结肠炎(UC)是一种病因尚不明确的直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病。其病程持续缓慢发展，发病期和缓解期交替发作，症状时好时坏，部分患者甚至持续加重［1］，可发生于任何年龄［2］。UC目前尚无彻底根治的方法且复发率高，临床治疗以缓解症状为主。多数专家认为，免疫因素在溃疡性结肠炎的病因中发挥着重要作用，因此可通过调节肠黏膜免疫功能达到治疗目的。

久泻宁颗粒的配方是原福建中医学院院长、全国著名中医药专家俞长荣教授治疗慢性泄泻的经验方，由参苓白术散与痛泻要方以健脾渗湿、调气止泻为治法化裁而来，临床治疗溃疡性结肠炎属于脾虚气滞湿阻证见久泻不愈者疗效颇佳。本实验通过异体免疫致大鼠慢性溃疡性结肠炎模型试验，研究久泻宁颗粒治疗慢性溃疡性结肠炎的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

多功能酶标仪 INFINITE M200Pro(TECAN公司);RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); TDL-4型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂); DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);85-2磁力搅拌器(常州国华电器有限公司);小型台式离心机(Eppendorf centrifuge5418);DZF数显真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 药品与试剂

久泻宁颗粒(自行制备);补脾益肠丸(广州陈李济药厂有限公司提供，批号 FJ243);柳氮磺胺吡啶片(上海信谊嘉华药业有限公司，批号H31020557);2，4-二硝基氯苯(天津市光复精细化工研究所，批号20081028);β-环糊精(简称 β-CD，国药集团化学试剂有限公司，批号69009360);弗氏完全佐剂(美国Sigma公司，批号 CAS 9007-81-2);总蛋白试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号lot 20T00150);SOD(批号20130724)、MDA (批号20130726)、IgG(批号20130702B)、IgM(批号20130702B)、TNF-α(批号20130702B)、IL-2(批号20130702B)均为南京建成生物工程研究所。

1.3 实验动物

清洁级SD大鼠雌雄各半，体质量(200±20)g，上海斯莱克实验动物有限公司提供(许可证号SCXK(沪)2012-0002)。实验动物在福建中医药大学动物饲养中心饲养和管理(环境设施合格证书SYXK(闽)2009-0001)。

1.4 药物与制备

1.4.1 受试药物 久泻宁颗粒严格按照制备工艺制作，实验用药为颗粒剂成型前的浓缩液。方中党参、白术等药材购自福建中医药大学国医堂中药房，经药学院车苏容副教授鉴定，符合 2010版《中国药典》各药材项下标准。

1.4.2 药物制备 取党参、野麻草、荷叶等6味药材加入8倍量水浸泡60 min，煎煮3次，每次煎煮1 h，合并 3次提取液过滤，滤液浓缩后水提醇沉［3］。取砂仁、白术等 3味药材加 5倍水煎煮 7 h［4］，水提醇沉后浓缩，挥发油包合［5］，并按照工艺要求制成颗粒剂成型前的浓缩液。

1.5 实验方法

1.5.1 实验动物分组 清洁级SD大鼠70只，雌雄各半，体质量(200±20)g，分层按随机数字表法分为空白对照组、UC模型对照组、UC模型+补脾益肠丸或柳氮磺胺吡啶片阳性对照组、UC模型+久泻宁颗粒高剂量组、中剂量组和低剂量组7组各10只。

1.5.2 模型制备 ①造模所需异种异体抗原及灌肠液的制备:异种异体抗原按照本课题组方法［6］稍作改进，取家兔新鲜结肠黏膜组织，以 PBS为介质充分匀浆后，－20℃条件下冷冻24 h后取出溶冻，并以4000 r/min速度离心30 min，取上清液用总蛋白试剂盒双缩脲法测定蛋白质含量。抗原乳化液:异种异体抗原与弗氏完全佐剂等体积配比。灌肠液:2，4-二硝基氯苯与无水乙醇等体积配比，浓度为2.5%(w/v);②异体免疫诱发法模型制备［7］:在大鼠左侧前后足趾皮下注射抗原乳化液，使大鼠获得8 mg异种蛋白。14 d后，在大鼠腹股沟部位皮下注射抗原乳化液，同样使大鼠获得8 mg异种蛋白。大鼠免疫刺激40 d后，用硅胶管插入大鼠肛门深约8 cm，局部灌肠1 mL灌肠液。拔出硅胶管后迅速捏紧大鼠肛门8 min，其间不断摇摆大鼠使灌肠液在肠道中分布均匀。待灌肠液不再从肛门流出，把大鼠放回笼中常规饲养。

1.5.3 给药方法 正常组和 UC模型对照组给予等量生理盐水，各给药组分别给予久泻宁颗粒高剂量26.8 g/kg、中剂量13.4 g/kg(相当于60 kg人的等效剂量147 g/d)、低剂量6.7g/kg(以上浓度均为生药含量)。补脾益肠丸1.65 g/kg(相当于60 kg人的等效剂量)、柳氮磺胺吡啶片组 0.25 g/kg (相当于60 kg人的等效剂量)，每天1次，连续灌胃14 d。

1.5.4 标本采集及处理 大鼠灌胃给药第14天后，禁食不禁水24 h，第21天用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血以3000 r/min离心10 min，分离血清，冰冻保存待测。取大鼠结肠平铺于冰块上进行大体形态学损伤评分，取结肠溃疡明显处做病理分析。

1.5.5 检测指标与方法 白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、免疫球蛋白 IgG、IgM测定采用ELISA法，总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定采用羟胺法，丙二醛(MDA)测定采用TBA法，总蛋白测定采用双缩脲法。

1.5.6 UC大鼠结肠大体形态学损伤评定标准［8］大鼠结肠大体形态学损伤按照程度轻重进行评分:若无溃疡、无炎症为0分;若无溃疡但局部充血为1分;若溃疡形成且不伴充血为2分;有1处溃疡伴炎症为3分;多处溃疡伴炎症为4分;若溃疡超过2 cm为5分;若溃疡超过2 cm且病变每超过1 cm加1分则为6～10分。

1.5.7 统计学方法 采用统计软件进行统计分析，结果以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 久泻宁颗粒对 UC模型大鼠检测指标的影响

表1显示，UC模型组与正常对照组比较，IL-2、SOD降低与TNF-α、IgG、IgM、MDA、损伤指数升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与 UC模型组比较，中药对照组可明显升高IL-2，降低MDA水平，差异有统计学意义(P＜0.01);可降低 TNF-α、损伤指数，差异有统计学意义(P＜0.05);西药对照组可明显升高IL-2、SOD，降低TNF-α、IgG、MDA、损伤指数水平，差异有统计学意义(P＜0.01);可降低IgM水平，差异有统计学意义(P＜0.05);久泻宁颗粒中剂量组可明显升高IL-2、SOD，降低MDA、损伤指数水平，差异有统计学意义(P＜0.01);可降低 IgG、IgM水平，差异有统计学意义(P＜0.05);久泻宁颗粒高剂量组可明显降低MDA水平差异有统计学意义(P＜0.01)，可升高IL-2，降低TNF-α，损伤指数差异有统计学意义(P＜0.05)。与阳性对照组比较，久泻宁高剂量组可明显降低MDA水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 久泻宁颗粒对UC模型大鼠检测指标的影响(±s)

表1 久泻宁颗粒对UC模型大鼠检测指标的影响(±s)

注:a与空白对照组比较:#P＜0.01，##P＜0.05;b与 UC模型组比较:*P＜0.01，＊＊P＜0.05;c与中药对照组比较:ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.05;d与西药对照组比较:☆P＜0.01，☆☆P＜0.05

组 别 鼠数 剂量(g/kg) IL-2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IgG(mg/mL) IgM(mg/mL) SOD(U/mg) MDA(nmol/mL)损伤指数正常对照组 10 10.58±0.62 7.79±0.98 16.83±1.08 10.23±0.70 98.58± 3.32 5.55±0.13 0 UC模型组 9 8.89±0.73# 9.05±1.13# 18.60±1.05# 12.13±1.38# 78.24± 2.74# 6.60±0.21# 3.56±1.13#中药对照组 8 1.65 9.73±0.43#* 8.15±0.55＊＊ 17.39±0.83＊＊ 10.95±0.52 79.12±15.08## 5.02±0.42#* 2.63±0.74#＊＊西药对照组 9 0.25 10.23±0.65* 7.97±0.31* 16.91±0.80* 10.78±0.59＊＊ 92.94± 4.78#* 4.47±0.14#* 2.33±0.87#*低 剂 量 组 8 6.70 9.25±0.83# 8.61±0.68## 18.17±0.86# 11.10±0.90## 79.97± 3.73# 6.43±0.16# 3.11±0.78#中 剂 量 组 9 13.40 9.62±0.84* 8.38±0.83 17.45±1.31＊＊ 10.59±0.62＊＊ 91.38± 3.54##* 4.72±0.38#* 2.11±0.93#*高 剂 量 组 9 26.80 9.34±0.74＊＊ 8.21±0.68＊＊ 17.69±0.69 10.99±0.50 81.60± 3.52# 5.35±0.28##*ΔΔ☆☆2.50±0.93#＊＊

2.2 久泻宁颗粒对UC模型大鼠结肠组织的影响

光镜下病理切片观察，正常对照组大鼠结肠黏膜上皮完整，腺体排列规则，结构清楚;UC模型组大鼠结肠黏膜脱落，溃疡面积大，溃疡点较多;阳性对照组均可见一层上皮组织盖住溃疡;久泻宁低剂量组可见两边上皮组织向中间愈合趋势;久泻宁中剂量组上皮组织基本完整，腺体排列欠规则，溃疡大部分基本愈合;久泻宁高剂量组上皮组织基本完整，腺体排列较规则，溃疡大部分基本愈合。

3 讨论

中医学尚无结肠炎病名，根据其临床证候特点属于“泄泻”“痢疾”等范畴，《黄帝内经》中就有关于洞泄、飧泄等记载。中华中医药学会在《中医内科常见病诊疗指南·西医疾病部分》中，将本病分为大肠湿热、脾气虚弱、脾肾阳虚、肝郁脾虚、寒热错杂、热毒炽盛6个证型［9］。脾虚湿盛是形成本病的重要病机，故益气健脾、除湿止泻为本病的常见治法之一。

本实验采用异体免疫诱发法制备动物模型，因多数专家认为免疫因素在溃疡性结肠炎的致病因素中发挥着重要作用，溃疡性结肠炎的临床和病理表现均可观察到肠黏膜的免疫功能异常。近年来，以免疫方法制备溃疡性结肠炎动物模型亦被多数专家认可。由于大鼠对局部免疫损伤有较强的修复能力，单纯的体液或细胞免疫反应异常不足以反映人类UC的病变过程。本实验免疫诱导法所致的溃疡性结肠炎动物模型，采用异种异体结肠黏膜组织致敏法，并加局部刺激造模。实验中模型组大鼠的血清IL-2、TNF-α、免疫球蛋白 IgG、IgM以及 SOD、MDA等免疫和炎症指标较正常组都发生明显变化，说明造模成功。

IL-2主要由CD4+T1细胞产生，可引起T细胞的增殖分化，而T细胞的活化又可抑制整个特异性免疫应答［10］。经免疫法导致大鼠溃疡性结肠炎的研究发现［11］，UC大鼠模型组血清中 IL-2活性明显低于空白对照组，治疗后血清中IL-2活性升高。本实验研究数据亦证明了这一点。

肿瘤坏死因子(TNF)能杀伤和抑制肿瘤细胞，参与某些自身免疫病的病理损伤，同时又是肠道上皮细胞增殖和凋亡的重要调节因子［12-13］。久泻宁颗粒可抑制TNF-α的产生，从而减少特异性或非特异性炎症分子的释放，缓解肠道免疫破坏作用。

在胃肠道疾病中，当免疫复合物IgG大量增多或沉淀在有病损器官中时，会给机体带来不良影响，造成局部肠黏膜损伤，同时溃疡性结肠炎患者在肠黏膜受到炎症侵犯时产生IgM。实验大鼠经久泻宁颗粒治疗后，其血清IgG和IgM明显下降，提示久泻宁颗粒可改善机体体液免疫功能，减轻肠道组织损伤，缓解UC症状。

氧自由基是促进炎症发生发展的重要因素，在UC模型中，肠组织中的MDA、损伤指数及在TNBS/乙醇灌肠后与对照组比较均有明显升高，肠组织中的SOD明显下降［14］。本实验数据显示，久泻宁颗粒可明显降低MDA水平，升高SOD水平。

从药效学实验数据可以看出，久泻宁颗粒中剂量组的总体疗效较高、低剂量组要好，说明药物剂量与疗效的关系一般不是简单的正比关系，而是类似抛物线的关系，剂量过小没有疗效，剂量过大反而起抑制作用，这为临床用药剂量的确定提供了客观实验依据。

本实验从调节机体免疫功能着手，研究久泻宁颗粒治疗溃疡性结肠炎的作用机理，发现久泻宁颗粒对UC模型大鼠免疫功能的异常可从多环节进行调节。但本文仅从整体的免疫学水平进行观察，有待于今后从血清药理及分子水平作进一步的研究。

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R285.5

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:1006-3250(2016)03-0355-03

2015-07-10

福建省科技厅社会发展重点项目(2012Y0040)

马少丹(1974-)，女，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事方剂配伍与临床运用研究。

△通讯作者:赵红霞(1970-)，女，副研究员，医学硕士，从事中医基础理论、方剂学及疑难病临床与研究，Tel:64089033，E-mail:zhaohongxia7000@163.com。