肺卫之气年节律的血浆代谢组学研究*

林 燕，王亚利，张明泉，王鑫国

（1.河北省中医院，石家庄 050011；2.河北医科大学，石家庄 050017；3.河北中医学院，石家庄 050090）

肺卫之气年节律的血浆代谢组学研究*

林 燕1，王亚利2△，张明泉3，王鑫国3

（1.河北省中医院，石家庄 050011；2.河北医科大学，石家庄 050017；3.河北中医学院，石家庄 050090）

目的：运用血浆代谢组学方法研究肺卫气虚证患者的血浆代谢组学特征，以探索伴随肺卫之气年节律的潜在标记物。方法：春、夏、秋、冬4个季节分别选择反复上呼吸道感染肺卫气虚证患者，设为疾病组给予玉屏风颗粒干预，60 d为1个疗程。同时每个季节设对应健康组，并分别对健康组及疾病组治疗前后采集血液；采用高效液相色谱⁃质谱联用仪检测3组的血浆代谢物，利用主成分分析、偏最小二乘法对检测到的数据进行统计分析。结果：四季推测出不完全相同的肺卫气虚证的潜在标志物；推测并反证了半胱氨酸、L⁃蛋氨酸是伴随肺卫之气年节律的潜在标记物。结论：四季发现不完全相同的潜在标志物与肺卫之气的节律性相关，推测半胱氨酸、L⁃蛋氨酸是伴随肺卫之气年节律的潜在标记物。

肺卫之气；年节律；代谢组学；血浆；潜在标志物

中医学天人相应理论认为，人与自然界是统一的，肺卫之气的运行也受四时阴阳的影响呈现一定的节律变化。本研究拟借助代谢组学技术，通过研究反复上呼吸道感染肺卫气虚证患者及玉屏风颗粒干预的血浆代谢组学特征，探索伴随肺卫之气年节律出现的潜在标记物。

1 临床资料

1.1 诊断标准与分型标准

1.1.1 反复上呼吸道感染的诊断标准 病程在1年以上，反复出现上感症状，间隙时间一般不少于7 d，每年上感≥5次［1］。

1.1.2 肺卫气虚证诊断标准 参照中华人民共和国卫生部颁布的《中药新药临床指导原则》［2］及相关文献［3］制定。主症：易患外感性疾病、畏风寒、自汗、舌淡苔白、脉浮弱；次症：反复咳嗽或咳喘、流涕、咽痛、乏力、不耐寒热。具备主症2项、次症2项或主症1项、次症3项以上即可诊断。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：符合上述反复上呼吸道感染，中医辨证符合肺卫气虚证的诊断标准；年龄在18～60岁，经检查血、尿常规、肝、肾功能、血糖及血脂正常，心电图无明显异常；同意且配合治疗者。排除标准：原发性免疫缺陷病患者；先天性呼吸道畸形患者；合并心、肝、肾和造血系统严重原发性疾病者，妊娠或哺乳期妇女；不符合纳入标准、未满规定观察期中断治疗者。

1.3 病例来源

分别在2012年8月7日（立秋）至2012年11月6日、2012年11月7日（立冬）至2013年2月3日、2013年2月4日（立春）至2013年5月4日、2013年5月5日（立夏）至2013年8月6日选出符合诊断条件的患者15例、30例、23例、17例设为疾病组；同时每个季节对应设健康组18例、31例、26例、10例。4个季节2组的性别、年龄分布等基线情况比较差异无统计学意义。

2 方法

2.1 治疗方法

疾病组给予玉屏风颗粒（主成分：黄芪、白术、防风，广州环球制药有限公司，每盒15袋），每次1袋，每日3次口服；并根据症状给予止咳等对症处理，嘱多休息、清淡饮食、多饮水等，60 d为1个疗程。健康组不予干涉正常生活。

2.2 检测方法与标本制备［4⁃6］

健康组、疾病组治疗前后分别空腹抽取静脉血2 ml（EDTA抗凝），血样常温静置2 h，3000 r／min离心10 min，取血浆0.5 mL置于冻存管中液氮罐中保存备用。

检测前将血浆样本放置4℃解冻复溶，乙腈、蒸馏水4℃过夜预冷。乙腈与血浆样本3∶1混合涡旋，离心机14000 r／m、10 min沉淀蛋白后，与乙腈、蒸馏水按照2∶2∶6稀释，涡旋移入液相小瓶备用。

质量控制样本（quality control，QC）制备方法：所有健康组样本室温解冻复融、涡旋振荡，分别吸取10 μL血清，再次涡旋振荡充分混匀后分装于EP管中，每管为100 μL，即为QC，其余处理同样本处理方法。

利用红外线成像仪测试，土墙日光温室散热有热桥存在[2]，主要是导热体的砼圈梁前坎，其次是后坡与前棚之间、后坡与侧墙之间的缝隙，造成温室密闭性不够，导致气体存在贯流散热。三是后坡结构简单，厚度不足，隔热保温能力差，四是散热面最大的为前棚面上的保温被，其质量好坏直接影响着温室的温度。彩钢后屋面主要是彩钢和墙体的缝隙，使用后，形成的彩钢板之间的缝隙，造成大量散热，以及聚苯板容重小，厚度不足，隔热性能达不到要求。

2.3 仪器设备与试剂

高效液相色谱⁃质谱联用仪（HPLC⁃MS）、色谱柱、乙腈、甲醇、蒸馏水等。

图1 春季疾病组和健康组的PCA图（黑方块代表疾病组，黑三角代表健康组，下同）

2.4 代谢数据处理［5］

经HPLC⁃MS得到代谢谱数据，采用SIMCA⁃P软件处理得到指纹图谱。处理过程采用数据格式转换、导入；图谱查看、对比（总离子流图、二维图像、三维图像、质谱图像）；去噪音；质谱峰提取；反卷积处理；峰排列、对齐、合并；峰合并后开始列表去噪音；缝隙填补处理等。数据处理采用多种方式，包括主成分分析（principle component analysis，PCA）、偏最小二乘法分析（partial least squares，PLS）。

3 结果

3.1 四季PCA图及潜在标志物

3.1.1 春季 ①疾病组与健康组PCA图。图1显示，PCA可以从总体上反映各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。判别模型质量好坏的主要参数为R2X，它代表模型的解释率，一般来说其值大于0.4即表示该模型可靠［4⁃6］。本分析在正离子模式下共获得6个主成分，累积R2X＝0.471，因此当前PCA模型适合解释2组之间的代谢差异。疾病组和健康组处在不同的区域，表明2组的代谢成分不同（代谢物成分相似的样本集中在相近的区域），疾病组的代谢出现紊乱。②疾病组治疗后与健康组的PCA图。图2显示，本分析在正离子模式下共获得4个主成分，累积R2X＝0.448。2组之间分离并不完全，表明疾病组在治疗后向健康组回归，其紊乱的代谢得以回调，两者的代谢成分相似；③潜在标志物。根据2组的PLS分析，对分组贡献较大的重要变量因子（VIP）值进行提取，经t检验筛选出差异变量，根据变量的质荷比、保留时间等，利用人类代谢组学数据库HMDB（www.hmdb.ca／metabolites）进行检索［5⁃6］。结果初步比对并推测出L⁃蛋氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸等9种物质为肺卫气虚证的潜在标志物（VIP＞1为差异有统计学意义；根据t值，P＜0.05为有统计学意义）。

图2 春季疾病组治疗后与健康组的PCA图（黑点代表疾病组治疗后，黑三角代表健康组，下同）

3.1.2 夏季 ①疾病组与健康组PCA图。图3显示，在正离子模式下共获得7个主成分，累积R2X＝0.421，2组分别处于不同的区域，可以被明显分类；②疾病组治疗后与健康组 PCA图。图4显示，正离子模式下共获得7个主成分，累积R2X＝0.407。2组处于相近的区域，部分融合交织，不能明显区分开，表明疾病组治疗后紊乱的代谢得以回调，向健康组回归；③潜在标志物。初步比对并推测出半胱氨酸、L⁃蛋氨酸、焦谷氨酸等7种物质为肺卫气虚证的潜在标志物。

表1 春季潜在标志物

图3 夏季疾病组与健康组PCA图

图4 夏季疾病组治疗后与健康组PCA图

表2 夏季潜在标志物

图5 秋季疾病组与健康组PCA图

图6 秋季疾病组治疗后与健康组PCA图

表3 秋季潜在标志物

3.1.3 秋季 ①疾病组与健康组PCA图。图5显示，本分析在正离子模式下共获得6个主成分，累积R2X＝0.813，适合解释2组之间的代谢差异；②疾病组治疗后和健康组的PCA图。图6显示，正离子模式下共获得4个主成分，累积R2X＝0.697；③潜在标志物。初步比对并推测出L⁃蛋氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、焦谷氨酸等6种物质为肺卫气虚证的潜在标志物。

3.1.4 冬季 ①疾病组与健康组PCA图。图7显示，正离子模式下共获得6个主成分，累积R2X＝0.499；②疾病组治疗后与健康组PCA图。图8显示，正离子模式下共获得5个主成分，累积R2X＝0.477；③潜在标志物。推测出 L⁃蛋氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、L⁃天冬氨酸等6种物质为肺卫气虚证的潜在标志物。

图7 冬季疾病组与健康组PCA图

图8 冬季疾病组治疗后与健康组PCA图

表4 冬季潜在标志物

3.2 伴随肺卫之气年节律的潜在标志物

四季出现不完全相同的潜在标志物，其中半胱氨酸、L⁃蛋氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸伴随肺卫气虚证全年，进一步标记这4种物质在4个季节疾病组／健康组的倍性变化值［6］，可以发现半胱氨酸、L⁃蛋氨酸呈现春夏较高、秋冬较低的趋势，符合肺卫之气春夏强、秋冬弱的节律，推测这2种物质是伴随肺卫之气年节律的潜在标记物。

3.3 潜在标志物的反证［6］

倍性变化是一种描述2个相比对象数量差异的方法。通过比对潜在标志物在疾病组／健康组和治疗后／健康组的倍性变化值，即可说明该物质在治疗前后的变化。对比并发现半胱氨酸和L⁃蛋氨酸治疗前后的倍性变化值呈上升趋势，近乎健康水平。说明随着患者疾病的恢复，半胱氨酸、L⁃蛋氨酸也相应地向健康组回调，从治疗角度反证了它们作为潜在证候标志物的可靠性。

表5 潜在标志物四季疾病组、健康组的倍性变化值

表6 半胱氨酸、L⁃蛋氨酸治疗前后倍性变化值比较

4 讨论

四季气候的变化对人体产生影响，人体阳气的屏障作用对气候因素尤其敏感［7］。本课题组曾做了大量相关研究［8⁃9］，表明肺卫之气存在春夏强、秋冬弱的趋势。

本研究的采样时间严格按照“四立”的时间点来确定季节的起止，结果显示在四季发现了不完全相同的潜在标志物，推测是因为季节的变化刺激机体后，机体进行相应调节，体内的代谢模式或通路也随之发生改变，使代谢产物产生变化所致。该结果与肺卫之气的节律性相关。

半胱氨酸有强化机体防卫、防御的能力。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸等组成，其活性基团是半胱氨酸残基上的巯基。Tunon［10］等研究显示，谷胱甘肽有明显昼夜节律；Smaaland［11］等的测定表明，健康成人骨髓内谷胱甘肽的含量存在昼夜变化。以上研究表明，谷胱甘肽存在明显的生物节律，作为谷胱甘肽的重要组成成分和活性基团提供者的半胱氨酸，其生物节律可以通过谷胱甘肽表现。

研究发现［12］，L⁃蛋氨酸有增加免疫的作用，它还是体内最重要的甲基供体，褪黑素的合成即需其提供甲基，褪黑素的节律性已有相关报道［13］。蛋氨酸在体内可以转化成半胱氨酸和谷胱甘肽，因此蛋氨酸的节律性可以通过褪黑素及谷胱甘肽表达。

虽然目前尚无半胱氨酸和L⁃蛋氨酸存在年节律的临床与动物实验报道，但它们具有增强免疫和春夏强、秋冬弱的特性，与肺卫之气具有卫外和节律性的特性相符合，因此推测它们是伴随肺卫之气年节律的潜在标志物。

本研究首次从系统生物学角度推测并反证了半胱氨酸和L⁃蛋氨酸是伴随肺卫之气年节律的潜在标志物，揭示了肺卫之气年节律的内源性物质基础和调控机制。但该研究尚在探索阶段，存在一定的不足。下一步课题组将进行人体其他代谢物（如尿液、唾液等）等研究，以期全方位、多层次地阐明肺卫之气年节律的本质。

［1］ 欧阳忠兴，柯新桥.中医呼吸病学［M］.北京：中国医药科技出版社，1994：439.

［2］ 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则［M］.北京：中国医药科技出社，2002：390.

［3］ 王洪琦，李建国.卫气虚弱与人类白细胞抗原相关性研究［J］.中国中医基础医学杂志，2004，10（3）：32⁃33.

［4］ 林燕，王亚利，王鑫国，等.玉屏风颗粒治疗肺卫气虚症的作用机制［J］.中医学报，2016，31（214）：344⁃347.

［5］ 林燕.基于代谢组学的肺卫气虚证候变化规律及中药复方干预的临床研究［D］.石家庄：河北医科大学，2014.

［6］ 林燕，王亚利，王鑫国，等.反复上呼吸道感染肺卫气虚证的血浆代谢组学特征及玉屏风颗粒干预的临床疗效［J］.中医杂志，2015，56（15）：1302⁃1306.

［7］ 杨学鹏.阴阳五行－破译·注释·激活［M］.北京：北京科学技术出版社，1998：92.

［8］ 卢志刚，王亚利，张明泉，等.冬夏季节变化对健康人外周血免疫淋巴细胞的影响［J］.北京中医药大学学报，2010，33（2）：106⁃109.

［9］ 师旭亮，王亚利，张明泉，等.从“天人相应”探讨季节变化对健康人外周血干扰素γ和白细胞介素10的影响［J］.中医杂志，2013，54（7）：573⁃57.

［10］ Tunon MJ.Arch Im Physiol Bioehim Biophis，1992，100：83⁃87.

［11］ Smaallad R et al.J Nat Cancer Insst，1991，83：1092⁃1098.

［12］ 卢广林，李东风.氨酸螯合锌对野鸭免疫器官及血液指标的影响［J］.饲料研究，2011（8）：40⁃41.

［13］ 张明泉，王亚利，郭霞珍，等.褪黑素在中医学天人相应理论中的地位和作用［J］.新中医，2009，41（3）：10⁃11.

Plasma Metabolism of the Lung Wei Qi in the Rhythm of the Year

LIN Yan1，WANG Ya⁃li2△，ZHANG Ming⁃quan3，WANG Xin⁃guo3
（1.TCM Hospital of Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050011，China；2.Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.TCM College of Hebei，Shijiangzhuang 050090，China）

Objective：By studying the plasma metabonomics characteristics of patients with Fei⁃Wei⁃qi deficiency syndrome（FWDQS），thus to explore the potential biomarkers along with the year biorhythm of qi of Fei⁃Wei.Methods：The patients with recurrent upper respiratory infection with FWQDS were recruited as sick groups respectively in spring，summer，autumn，and winter.Yupingfeng Granule（YPFG）were given as intervention，60 days is one therapeutic course.The control groups were set correspondently in four seasons.The blood was collected respectively on patients in control groups and sick groups before and after treatment.The plasma metabolites were detected using high performance liquid chromatography⁃mass spectrometry，statistical data were analyzed by principal component analysis and partial least squares.Results：The potential biomarkers of FWQDS were not completely the same in four seasons.L⁃Cysteine and L⁃Methionine were inferred and disproved as the possibly potential biomarkers along with the year biorhythm of qi of Fei⁃Wei.Conclusions：There were not exactly the same potential biomarkers in four seasons.This result is associated with the biorhythm of qi of Fei⁃Wei.L⁃Cysteine and L⁃Methionine were the potential biomarker along with the year biorhythm of it.

Qi of Fei⁃Wei；Year Biorhythm；Metabonomics；Plasma；Metabolic Biomarkers.

R256.1

：A

：1006⁃3250（2016）10⁃1336⁃04

2016⁃03⁃18

国家自然科学基金资助项目（81273609）⁃基于代谢组学的卫气节律机制及方药干预研究

林 燕（1972⁃），女，河北石家庄人，副主任医师，医学博士，从事中西医结合儿科呼吸系统、消化系统疾病及疑难杂症的临床与研究。

△

：王亚利，Tel：0311⁃86261276，E⁃mail：Wang1955＠163.com。