健脾消癌方对大肠癌肝转移裸鼠模型肝组织MMP⁃9、TIMP⁃1表达的影响*

杨 晓，蒋益兰，李勇敏，谭小宁，简小兰，罗 星

（1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006）

健脾消癌方对大肠癌肝转移裸鼠模型肝组织MMP⁃9、TIMP⁃1表达的影响*

杨 晓1，蒋益兰2△，李勇敏2，谭小宁2，简小兰1，罗 星2

（1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006）

目的：研究中药健脾消癌方对大肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中基质金属蛋白酶⁃9（MMP⁃9）及组织金属蛋白酶抑制剂⁃1（TIMP⁃1）表达的影响，探索其防治大肠癌肝转移的分子机制。方法：建立人大肠癌细胞肝转移裸鼠模型，将模型按随机数字表法分为健脾消癌方组、阳性对照组、模型组、空白对照组并观察各组裸鼠肝转移情况，测定其肝组织中MMP⁃9、TIMP⁃1表达量。结果：健脾消癌方组肝转移率低于模型组及阳性对照组；健脾消癌方组肝组织中MMP⁃9及TIMP⁃1表达低于阳性对照组及模型组，高于空白对照组；健脾消癌方组MMP⁃9／TIMP⁃1比值低于阳性对照组及模型组，而与空白对照组间比较差异无统计学意义。结论：健脾消癌方可抗结肠癌肝转移，其机制可能与下调MMP⁃9及TIMP⁃1表达、保持二者间的动态平衡有关。

健脾消癌方；大肠癌；肝转移；MMP、TIMP表达

大肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。肝转移是结直肠癌患者预后差的主要原因。前期研究证实，健脾消癌方能降低大肠癌术后患者的复发转移率，并可降低大肠癌术后裸鼠模型肝转移率。基质金属蛋白酶（MMPs）及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）可通过调节细胞外基质降解及血管生成情况，在一定程度上影响结直肠癌患者的复发转移率。其中MMP⁃9能特异性地破坏基底膜的明胶纤维，从而促进结直肠癌转移尤其受到重视［1］。而TIMPs是MMPs的天然抑制物，其中TIMP⁃1能抑制绝大多数MMPs活性［2］。因此，本实验拟从MMP⁃9及TIMP⁃1入手，探索健脾消癌方抗大肠癌肝转移的分子机制。

1 材料

1.1 动物与细胞

BALB／c⁃nu裸鼠48只，雌雄各半，4～6周龄，体质量16～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司（合格证号43004700001492），于 SPF环境中饲养。人结肠癌细胞株HCT116购买于中南大学湘雅医学院细胞中心。

1.2 主要试剂及仪器

小鼠MMP⁃9、TIMP⁃1试剂盒，上海国药生物有限公司；倒置显微镜，德国LEICA公司；CO2恒温孵育箱，法国Jouan6500系列；电泳仪，Bio⁃rad公司；手术相关器械由湖南省中医药研究院附属医院实验室提供。

1.3 药物及制备

健脾消癌方由党参、白术、茯苓、法夏、黄芪、灵芝、炒枳壳、薏苡仁、仙灵脾、郁金、莪术、白花蛇舌草、半枝莲、重楼、甘草组成。以上药物依照《中华人民共和国药典》（2012年版）标准规格采购于湖南省中医药研究院附属医院中药房。取以上15味药，5倍量处方，10倍温水浸泡0.5 h，加热煎2 h趁热过滤。药渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h趁热过滤。将3次水煎溶液混匀、过滤，减压浓缩至浓度为2.1 g／ml的溶液，0.25 g／支，密封后4℃保存备用。阳性对照药5⁃氟尿嘧啶购自北京紫竹药业有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养

人结肠癌HCT116细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞铺满80% ～90%时予以传代。细胞培养至约合80个T25瓶量时（每瓶长满约2×106个细胞），于对数生长期用胰酶消化后收集细胞，并以2000 r／min离心5 min后，用生理盐水调整细胞浓度约4× 107／ml，收集好的细胞尽快接种。

2.2 模型制备

随机选出 38只裸鼠造模，于无菌环境下用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠（40 mg／kg）后，在左下腹切开约2.5 cm切口，使盲肠完全暴露于腹腔外。用100 ul微量注射器吸取50 ul HCT116细胞后，与盲肠壁呈30°角倾斜进针，进针深度约5 mm，将细胞注入盲肠浆膜和肌层之间，注射后用棉签在距离注射点2mm处轻压并迅速退针。确保无细胞悬液外渗后，用3%碘酒清洁注射区域以免种植转移，将盲肠回纳腹腔，以3⁃0丝线间断缝合腹壁。

2.3 分组给药

接种细胞15 d后，造模裸鼠存活32只，随机选择2只处死后解剖腹腔观察肝脏表面，均有白灰色转移结节形成。其余30只按随机数字表法分为健脾消癌方组、阳性药物对照组及模型组，10只未接种细胞的裸鼠作为空白对照组，每组10只，雌雄各半。造模后第15天开始给药。健脾消癌方按70 kg成人320 g／d用量计算，20 g裸鼠每日剂量为320× 0.0026／0.02＝41.6 g／kg，中药溶液灌胃量按2 ml／100 g计算，每日1次；阳性对照组裸鼠腹腔注射浓度为13 mg／ml的5⁃Fu（生理盐水配制），每次给药10 ml／kg，隔3 d给药1次；模型组及空白对照组以生理盐水灌胃2 ml／100 g，每日1次。连续给药4周，末次给药2 h后处死。

2.4 观察指标

2.4.1 肉眼观察 动物死亡或处死后即刻打开腹腔，充分暴露肝脏，仔细观察肝脏表面有无转移结节，同时观察腹腔淋巴结及其他脏器有无转移。

2.4.2 形态学观察 裸鼠死亡后，取裸鼠部分肝脏标本（有转移结节者以结节为中心取材）以10%福尔马林固定，24 h后以苏木精⁃伊红（HE）染色制作病理切片，置于显微镜下观察。

2.4.3 肝组织MMP⁃9、TIMP⁃1蛋白表达检测

称取0.1 g肝组织，用PBS洗涤1次后加入200 ulRIPA裂解液提取细胞总蛋白，经过电泳及转膜后加入100 ml／L 5%的脱脂奶粉，封闭60 min，加入MMP⁃9、TIMP一抗（稀释比例1∶200），4℃过夜，TBS⁃T洗3次后将稀释后的二抗（用封闭液稀释HRP标记的二抗，稀释比例1∶3000）与膜共同孵育45～60 min。TBS⁃T洗3次后，采用化学发光试剂曝光显影，扫描底片。

2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较符合正态分布，方差齐性采用LSD法，符合正态分布、方差不齐采用Tamhane′s T2法，不符合正态性用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 健脾消癌方对肝转移的影响

图1显示，模型组、阳性对照组及健脾消癌方组可在裸鼠肝脏表面见1个或多个白灰色转移结节，部分裸鼠可见肺及腹腔淋巴结转移。

图2显示，光镜下观察可见空白对照组肝脏细胞生长正常，肝小叶结构完整。健脾消癌方组、阳性对照组以及模型组可见肝小叶结构破坏。部分裸鼠肝脏可见浸润性生长的癌细胞团，切片染色示分化差的腺癌，部分裸鼠肝脏镜下可见坏死组织带。健脾消癌方组中5例未见肝转移瘤，其中1例可见异常增生的肝细胞，深染，未见细胞浆，肝细胞呈核分裂状态。

3.2 健脾消癌方对肝组织MMP⁃9、TIMP⁃1表达的影响

表1显示，与空白对照组比较，各组MMP⁃9及TIMP⁃1表达均增加（P＜0.05）；健脾消癌方组MMP⁃9及TIMP⁃1表达低于阳性对照组及模型组（P＜0.05）。提示结肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中MMP⁃9及TIMP⁃1表达升高，健脾消癌方能降低大肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中MMP⁃9及TIMP⁃1蛋白表达水平。此外，模型组及阳性对照组MMP⁃9／TIMP⁃1比值较空白对照组明显增加（P＜0.01）；而健脾消癌方组与空白对照组比较，MMP⁃9／TIMP⁃1比值差异无统计学意义（P＞0.05）；健脾消癌方组MMP⁃9／TIMP⁃1比值低于阳性对照组及模型组（P＜0.01）。提示结肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中MMP⁃9／TIMP⁃1有升高趋势，健脾消癌方能降低大肠癌术后肝转移裸鼠模型肝组织中MMP⁃9／TIMP⁃1比值。

图1 造模各组裸鼠肝转移情况肉眼观察

图2 各组裸鼠肝脏病理切片镜下观察

表1 各组裸鼠肝转移率及肝组织中MMP⁃9、TIMP⁃1蛋白表达比较

4 讨论

肿瘤的侵袭转移是大肠癌患者死亡的主要原因。细胞外基质（ECM）是肿瘤转移过程中必须克服的生理屏障。大量研究证实，MMPs是降解ECM最重要的酶类。Derek C.Marshall［3］等经研究发现，MMP⁃9的选择性抑制剂可减慢外科原位移植结直肠癌模型小鼠肿瘤生长速度，并降低转移发生率，表明MMP⁃9可促进结直肠癌转移。TIMPs作为MMPs的天然抑制物可下调MMPs活性，对于维持ECM的稳态具有重要作用。TIMP⁃1可通过与MMPs或其前体结合而抑制大多数MMPs活性。本实验研究发现，结肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中 MMP⁃9及TIMP⁃1均有升高趋势，中药复方在抗大肠癌肝转移的同时，二者表达水平均降低。

陶国全［4］研究发现，TIMP⁃1蛋白在结直肠癌组织中表达增高，此结果与本研究一致。并发现TIMP⁃1表达高低与肿瘤大小、淋巴转移、临床分期呈正相关，下调TIMP⁃1基因表达能显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力，提示TIMP⁃1除可通过MMPs途径抑制ECM降解外，还可能通过其他途径促进结直肠癌细胞侵袭转移。维持TIMP⁃1与其他相关分子间的动态平衡，可能是改善大肠癌患者预后的关键。

健脾消癌方是蒋益兰教授根据多年临床经验以“健脾益气，化瘀解毒”为法创制而成。前期研究表明［5］，该方能在一定程度上降低大肠癌术后复发转移率，延长患者生存期。本研究结果表明，健脾消癌方可下调结肠癌肝转移裸鼠模型肝组织中MMP⁃9、TIMP⁃1表达，恢复MMP⁃9／TIMP⁃1比值，提示健脾消癌方可能通过下调MMP⁃9及TIMP⁃1表达，保持二者间的动态平衡，发挥抗结肠癌肝转移作用，其具体调节机制有待进一步的研究。

［1］ 刘超，仰曙芬，付玉.MMP2、MMP9与结直肠癌的研究进展［J］.中华结直肠疾病电子杂志，2014，3（3）：195⁃197.

［2］ Visse R，HideakiN.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases structure， function， and biochemistry［J］.Circ Res，2003，92：827.

［3］ Derek C.Marshall1，Susan K.Lyman1，Scott McCauley，etal.Selective Allosteric Inhibition of MMP9 Is Efficacious in Preclinical Models of Ulcerative Colitis and Colorectal Cancer［J］.PLOS One，2015，10（5）：e0127063.

［4］ 陶国全.TIMP1在结直肠癌中的作用及其调控机制［D］.广州：南方医科大学，2013.

［5］ 蒋益兰，俞天俊，赵晔.健脾消癌方治疗老年中晚期大肠癌临床观察［J］.中国中医药信息杂志，2014，21（3）：94⁃96.

Effect of Jianpi Xiaoai Prescription on MMP⁃9 and TIMP⁃1 Expression in the Liver Tissue on Nude Mice Model of Colorectal Cancer with Liver Metastasis

YANG Xiao1，JIANG Yi⁃lan2△，LI Yong⁃min2，TAN Xiao⁃ning2，JIAN Xiao⁃lan1，LUO Xing2
（1.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.The Hospital Attached to Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410006）

Objective：To investigate the effects of Jianpi Xiaoai Recipe on Matrix metalloproteinases⁃9（MMP⁃9）and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase⁃1（TIMP⁃1）expression in liver tissues of nude mice model of liver metastasis of colon cancer.Methods：The HCT116 cells were used to establish the model of colon cancer liver metastasis in nude mice.Then the models were randomly divided into Jianpi Xiaoai Recipe group，positive control group，model group and blank control group.The expression of MMP⁃9 and TIMP⁃1 in liver tissues was tested by Western Blot method.Results：The liver metastasis rate and the expression of MMP⁃9 and TIMP⁃1 in the liver tissues were significantly lower in Jianpi Xiaoai Recipe group than in the model group and the positive control group；The MMP⁃9／TIMP⁃1 ratio was lower in Jianpi Xiaoai Fang group than in the model group and the positive control group，but there was no significant difference between Jianpi Xiaoai Recipe group and the blank control group.Conclusion：Jianpi Xiaoai Recipe could reduce the liver metastasis rate of colon cancer，the mechanism may down regulats the expression of MMP⁃9 and TIMP⁃1 in liver tissues，and maintain the dynamic balance between them.

Jianpi Xiaoai Recipe；Colorectal cancer；Liver metastasis；The expression of MMP⁃9 and TIMP⁃1

R285.5

：B

：1006⁃3250（2016）10⁃1323⁃03

2016⁃04⁃06

国家自然科学基金面上项目（81373602）⁃结直肠癌转移状态与TGF⁃β调控网络的相关性及益气化瘀解毒方干预作用研究；湖南省科技计划科研条件创新专项（2013TT1004）⁃SW620型裸鼠结肠癌肝转移模型及血管生成因子调控的研究

杨 晓（1989⁃），女，河南商丘人，医学博士，从事中西医结合肿瘤防治方法与规律研究。

△

：蒋益兰（1961⁃），女，湖南邵阳人，主任医师，博士研究生导师，湖南省名中医，从事中西医结合肿瘤防治方法与规律研究，Tel：15574977175，E⁃mail：tianshangren624＠163.com。