抗氧化软胶囊中的人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹酚酸B的含量测定

2016-03-26马方圆王春贺李佳芮金洋黄帮蕊金向群

特产研究 2016年4期

马方圆，王春贺，李佳芮，金洋，黄帮蕊，郭，金向群

(吉林大学药学院，长春130021)

抗氧化软胶囊具有清除体内自由基、抗氧化的作用，其主要成分为三七、丹参、川芎。三七作为传统的珍贵中草药[1]，功效显著，可散淤止血、消肿止痛，用于治疗多种出血性疾病，对机体的抗自由基起到了相当大的辅助作用，可以有效抵抗自由基对机体的损害，预防常见疾病的产生与恶化；丹参是较为常见的中草药，是唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血调经、凉血消痈、养血安神等功效，对超氧阴离子具有清除的能力。为了对抗氧化软胶囊进行质量控制，本研究使用反向高效液相色谱法建立抗氧化软胶囊中有效成分的含量测定方法[2，3]。

1　仪器与试剂

1.1　仪器

Waters2489液相色谱仪、AB204-N分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-250D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JT2001电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)；色谱填充柱：AgilentTC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)(美国安捷伦科技有限公司)。

1.2　试剂

抗氧化软胶囊(吉林大学药学院药剂教研室自制)；三七皂苷R1(批号：15090815，含量：98.67%)、人参皂苷Rg1(批号：15042215，含量：98.1%)、丹酚酸B(批号：15051708，含量：99.02%)(北京恒元启天化工技术研究院)；乙腈、磷酸、甲醇(色谱级，Fisher Scientific公司)；水为三蒸水。

2　方法与结果

2.1　薄层检测

取本品1粒，剪开，将内容物置于小烧杯中，用10mL环己烷将内容物转移至分液漏斗中，用甲醇萃取2次，每次10mL，合并上层液，蒸干用10mL甲醇溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮IIA标准品，制成1mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按照2015版中华人民共和国药典(以下简称药典)附录VIB薄层色谱法操作，吸取上述2种溶液各6μL，分别点于硅胶G薄层板上，以V石油醚(30℃～60℃)-V乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干。结果在与标准品色谱相应位置显示相同暗红色斑点(图1)。

2.2　含量测定

2.2.1对照品溶液的制备精密称定经过P2O5干燥24h的三七皂苷R11.2mg、人参皂苷Rg12.3mg和丹酚酸B 1.5mg的标准品，于5mL棕色量瓶中用甲醇定容，制备成含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹酚酸B的混合标准溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取本品软胶囊4粒，剪开，将内容物置于小烧杯中，摇匀以后用10mL环己烷将内容物转移至分液漏斗中，70%乙醇萃取3次，每次15mL，合并下层液蒸干，使用甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性样品的制备剔除三七丹参药材制成内容物，并进行分析。

2.2.4色谱条件1)色谱条件筛选：由于三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的液相条件基本相同，所以本实验主要筛选与丹酚酸B相适应的色谱条件。波长筛选：药典规定，203nm为三七皂苷R1和人参皂苷Rg1测定波长，286nm为丹酚酸B的测定波长，分别在上述波长条件下对丹酚酸B进行6次含量测定(表1)；洗脱液比例的筛选：分别于乙腈∶0.05%磷酸水溶液体积比为19∶81及21∶79的流动相比例下6次比较分离度与Rg1出峰总时间(表2)。

表1液相波长选择

Table1Liquidwavelengthselective

表2液相洗脱剂比例选择

Table2Liquideluentproportionalselection

2)色谱条件选择：由表1可知，丹酚酸B在203nm波长处的测定含量与药典规定283nm波长处测得的含量无显著性差异(P>0.05)，同时203nm又是药典规定的三七皂苷R1和人生皂苷Rg1的测定波长，因此最终选取203nm作为本品的测定波长；对于流动相的选择，在使用21∶79的流动相与其20∶80的洗脱剂比例下相比较P<0.05，分离度具显著性差异，与19∶81相比较而言，且分离时间较短，故使用21∶79的流动相。筛选后的液相色谱条件：色谱填充柱：AgilentTC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液为21∶79；检测波长：203nm；流速：1mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；理论塔板数：按三七皂苷R1色谱峰计算不得低于4000。

3)测定方法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件分析。结果显示，在供试品的色谱中，与对照品色谱相同位置上出现相同保留时间的色谱峰，且阴性溶液无干扰(图2、图3、图4)。

2.2.5线性关系考察分别量取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和丹酚酸B的标准品，于5mL 棕色量瓶中用甲醇定容，制备成三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和丹酚酸B含量分别为0.241mg/mL、0.462mg/mL和0.304mg/mL的混合标准溶液，分别取5μL、10μL、15μL、20μL进样，以进样量X(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归分析。得3种成分的线性回归方程，3种成分分别在1.205μg～4.820μg、2.310μg～9.240μg、1.520μg～6.080μg 范围内线性关系良好(表3)。

2.2.6精密度实验精密吸取标准品混合溶液10μL，连续重复进样(n=6)，分别测定峰面积，计算得其RSD值为0.3581%，表明此方法精密度良好。

表33种有效成分的线性回归方程

Table3Linearregressionequationofthreeactiveingredients

2.2.7重复性实验称取同一批次抗氧化软胶囊，每次1g，用“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，再进行含量测定分析，结果样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和丹酚酸B量平均值分别为8.32mg、21.88mg和11.21mg(n=6)，RSD值为0.6361%，表明此方法重复性良好。

2.2.8稳定性实验精密吸取放置0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h的供试品溶液10μL，按照“2.2.4”项下条件进行样品分析，分别测定其色谱峰面积。结果显示，RSD值为0.9435%，供试品溶液在24h内保持稳定。

2.2.9加样回收率实验分别称取抗氧化软胶囊内容物6份，制备成样品，并且加入适量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和丹酚酸B标准品，在“2.2.4”项液相色谱条件下测定和计算回收率，其结果见表4。

表4回收率试验测定结果

Table4Recoverytestmeasurementresults

2.2.10样品含量测定对3批抗氧化软胶囊中3种成分的含量进行测定，制备方法同供试品的制备，结果如表5。

表5抗氧化胶囊中3种成分的含量测定结果

Table5Contentofantioxidantcapsulesthreecomponentsofthemeasurementresults

3　讨论

3.1　高效液相条件的筛选

分别在286nm、203nm处对样品进行测定发现，含量差异较小，且在波长203nm处3种有效成份均可出峰；对于洗脱剂的比例进行筛选发现，在V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液为20∶80时出峰整体时间较长，在V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液为19∶81的洗脱条件下3种有效成分的分离度较小，故选择波长203nm，洗脱剂为乙腈：0.05%磷酸水溶液，且比例为21∶79；对液相色谱柱的柱温也进行筛选，结果发现，柱温低于25℃时较好，在20℃最佳，故选用20℃作为最适柱温。