黑芝麻炮制前后芝麻素含量变化与抗氧化活性研究

李淑军，刘鹏，付智慧，孙美玲，胡慧华

(北京中医药大学中药学院，北京100102)

黑芝麻始载于《神农本草经》，列为上品，名胡麻，为脂麻科植物脂麻(SesamumindicumL.)的干燥成熟种子[1]，性甘、平，归肝、肾、大肠经，能够补肝肾、益精血、润肠燥。陶弘景谓之为“八谷之中，唯此为良”。临床常用于治疗肝肾不足、虚风眩晕、肠燥便秘、病后虚弱等病症[2]。九蒸九制后有乌发之功，但需久服多服。古今用法各异，生熟功效不同。

芝麻木脂素是黑芝麻中的主要生理活性成分，总质量分数达0.5%～1.0%，也是非常优良的天然抗氧化剂。芝麻木脂素包括脂溶性木脂素(Lignans)和含有配糖体的水溶性木脂素(Lignans glucosides)。脂溶性木脂素有芝麻素(Sesamin)、芝麻酚(Sesamol)、芝麻林素(Sesamolin)等；水溶性木脂素则是由1～3个葡萄糖相连形成的极性较强的糖苷[3]。芝麻素和芝麻林素是芝麻中主要的木脂素，其质量分数分别为总木脂素的0.2%～0.5%和0.1～0.3%[4]。

本实验通过检测黑芝麻生品及炮制品所含芝麻素的含量，探究炮制次数对芝麻素含量的影响，并以清除自由基实验为依据，测定样品溶液对于羟自由基、DPPH自由基的清除作用，比较炮制前后黑芝麻抗氧化活性的强弱，以期为黑芝麻在中药领域的研究提供参考。

1　材料与仪器

1.1　原料与试剂

黑芝麻生品、不同蒸制次数的炮制品、芝麻素对照品(上海源叶生物科技有限公司)；芝麻素(纯度99.24%，北京中医药大学中药炮制学实验室自制)；石油醚、乙醇、甲醇、HCL、H2O2、硫酸亚铁铵(北京化工厂)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)(北京博奥拓达科技有限公司)；邻二氮菲(天津市光复科技发展有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(东京化成工业株式会社)。

1.2　仪器设备

Agilent 1100 series(惠普公司)；色谱柱：YWG-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)(北京迪马欧泰科技发展中心)；18系列紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-2000A(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)；电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。

1.3　色谱条件

流动相：甲醇∶水(70∶30)；检测波长：287nm；流速：1mL/min；柱温：室温。

2　试验方法

2.1　黑芝麻的炮制方法

取黑芝麻1000g，取50g作为生品，其余药材清蒸45min，晒干。取50g，作为1制样品。余下的900g，再清蒸45min，晒干，取出50g，作为2制样品。同法，共取10次，获得10份样品。

2.2　对照品溶液的制备

精密称取芝麻素对照品5mg置100mL三角瓶中，加甲醇制成芝麻素含量为0.05mg/mL的溶液。

2.3　供试品溶液的制备

取样品1.0g，加入硅藻土2.0g拌匀，置索氏提取器中，加入甲醇100mL，85℃提取4h。回收甲醇至干，加入氯仿溶解，转移至容量瓶中，并定容至25mL，过滤，取续滤液5mL，挥至近干，加入0.5g硅胶(160目～200目)拌样，干法上柱(柱直径1.5cm，过160目～200目硅胶3.0g)。用石油醚-氯仿(2∶1)洗脱，弃去前60mL洗脱液，收集60mL后，改用氯仿洗脱，再收集60mL，合并洗脱液，回收溶剂至干。用甲醇溶解，转移至容量瓶中，并定容至10mL。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4　黑芝麻样品的制备

称取105℃烘干后的黑芝麻5.00g，粉碎机粉碎，将粉末置于圆底烧瓶中，加入12倍量的石油醚，水浴65℃回流1h，挥去石油醚，粉末加12倍量的90%乙醇，55℃超声提取30min，取出静置2h，然后旋转蒸发除去90%乙醇，甲醇定容10mL，作为供试液。取定容后的溶液0.5mL，用甲醇定容到10mL，作为样品溶液。

3　方法学考察

3.1　线性关系与工作曲线

取对照品溶液，分别进样5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，按“1.3”项下方法测定。以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标进行回归处理，得回归方程：Y=1127.9X-41.77，相关系数r=0.9999，芝麻素在0.2μg/mL～1.0μg/mL范围内有良好的线性关系。

3.2　提取时间的确定

由于本品用索氏提取法提取，所以试验中只比较了不同提取时间的影响。取同一批生品5份，精密称定，加入硅藻土2.0g，拌匀，置索氏提取器中，加入100mL甲醇，提取2h、3h、4h、5h、6h，再按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样5μL。按“1.3”项下方法测定，结果见表1。

表1提取时间确定

Table1Determinationofextractiontime

结果表明，在2h～6h中，芝麻素提取率稳定，考虑到提取的完全性，选定提取时间为4h。

3.3　供试品溶液稳定性考察

取同一批生品1.0g，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，间隔一定时间，按“1.3”项下方法测定，放置时间为0h、2h、4h、6h、8h，进样量5μL，结果得RSD值为1.51%。结果表明，供试品溶液在8h内保持稳定。

3.4　精密度试验

取同一批生品1.0g，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，并按“1.3”项下方法连续测定5次，进样量5μL，RSD为0.77%，结果表明，该仪器精密度良好。

3.5　重复性试验

取同一批生品5份，各1.0g，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，并按“1.3”项下方法分别测定，进样量5μL，RSD为0.54%，结果表明重复性良好。

3.6　回收率试验

采用加样回收实验方法测定，取同一批已知含量的样品5份，精密称定，分别精密加入芝麻素对照品溶液(0.4228mg)各10mL，再按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样量5μL，测定其含量，结果见表2。

表2加样回收率

Table2Recoveryofsample

4　结果

4.1　芝麻素含量的测定

实验组炮制前后样品取样5μL，按方法学考察测定方法进行测定，结果见表3。

表3芝麻素含量测定结果

Table3Resultsofthecontentofsesamin

结果表明，随着蒸制次数的增加，芝麻素的含量逐渐下降。9制样品中芝麻素的11:12 2018-3-26一步研究。

4.2　黑芝麻生品和不同炮制次数的黑芝麻炮制品对羟自由基(·OH)清除作用

取12支10mL比色管，依次编号，分别依次加入7.5mmol/L硫酸亚铁铵溶液0.3mL、7.5mmol/L邻二氮菲溶液0.3mL、pH 7.47 Tris-HCL缓冲液1mL；之后1号管加纯净水1mL，2～13号管分别加入7.5mmol/L H2O2溶液1mL；然后3～12号管加入生品及不同炮制次数的黑芝麻样品溶液1mL。所有比色管加甲醇定容到10mL，37℃水浴1h。以甲醇为参比，510nm处测吸光度值。平行测3次，取平均值，分别计算黑芝麻生品及炮制品的羟自由基清除率(P)[5]。

P=(A样品-A损)/(A未损-A损)×100%

式中：A样品、A未损、A损分别为加入样品溶液的羟自由基体系，不加H2O2及加入H2O2体系的吸光度。结果见图1。

由图1可知，随着蒸制次数的增加，黑芝麻生品及黑芝麻炮制品均具有一定的羟自由基清除作用，但随着蒸制次数的增加，羟自由基的清除率呈现出减小的趋势，生品对羟自由基的清除率最大，而7制样品以后基本保持不变。换句话说，生品黑芝麻的抗氧化活性强于炮制品。此结果与本实验前期测定芝麻素含量的结果相吻合，说明芝麻素是黑芝麻中抗氧化活性的主要成分。

4.3　黑芝麻生品和不同炮制次数的黑芝麻炮制品对DPPH自由基的清除作用

取11支10mL比色管，依次编号，分别依次加入4.5mL 60μmol/L的DPPH溶液；1号管中加入100μL甲醇溶液，2～11号管加入生品及不同炮制次数的黑芝麻样品溶液100μL。各比色管加甲醇定容到5.0mL，振荡、避光反应30min，以甲醇为参比，516nm处测吸光度，平行测定3次，求平均值。分别计算黑芝麻生品及炮制品的清除率(P)。

P=(A0-A样品)/A0×100%

式中：A0、A样品分别为不加样品溶液的DPPH自由基体系、加样品溶液的DPPH自由基体系的吸光度。结果见图2。

由图2可知，黑芝麻生品及炮制品均具有一定程度的DPPH自由基清除作用，但随着黑芝麻蒸制次数的增加，DPPH自由基的清除率逐渐减小，生品对DPPH自由基的清除率最大，7制样品以后清除率基本保持不变。此次实验的结果与前期对芝麻素含量的测定结果一致，表明黑芝麻具有很强的抗氧化活性，而随着芝麻素的减少，其抗氧化活性逐渐减弱。

5　讨论

芝麻素具有抗氧化、抗菌、调节血脂、稳定血压、保护肝功能及抑制肿瘤等多种药理作用，芝麻素是黑芝麻中起主要生理活性作用的木脂素类化合物。实验结果揭示，随着黑芝麻蒸制次数的增加，其中的芝麻素含量降低，从而使炮制品的抗氧化活性降低。结果说明，黑芝麻具有很强的抗氧化性能，芝麻素是黑芝麻抗氧化的主要成分，蒸制以后黑芝麻的抗氧化活性降低与蒸制过程中芝麻素含量的降低有着密切的关系。

我国黑芝麻资源丰富，大多被用作油料作物，其药用价值一直被忽略。随着研究技术的不断更新，黑芝麻的药用前景更加值得深入研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[K].北京:中国医药科技出版社,2015:344.

[2]Gao H Y.Use Sesamum indium L.to benefit the gallbladder and eliminate the stone[J].Shandong J Traditi Chin Med,1996,15(6):266.

[3]何晓梅,谷仿丽,张颖,等.芝麻木脂素超声提取工艺优化及其抗氧化性能[J].生物加工过程,2013,11(6):53-54.

[4]唐传核,彭志英.芝麻木酚素“芝麻素”研究概况[J].粮食与油脂,2000,(6):37-39.

[5]许鰓,曹跃,周翎,等.狗脊炮制前后抗氧化活性的研究[J].中华中医药学刊,2011,29(11):2424-2426.