应用宏基因组测序开展银黑狐真菌皮肤病分子流行病调查

易立，曹智刚，仝明薇，程悦宁，程世鹏

(中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，长春130112)

皮肤真菌病是一种感染畜禽和人类的人兽共患病，它是一种浅表皮肤病，主要症状是患部断毛、掉毛或出现圆形脱毛区，皮屑较多。该病是一种接触性人兽共患病[1]，对毛皮动物的皮张质量造成了较大损害和经济损失，同时也给养殖员带来威胁[2]。

皮肤真菌病在我国不同地域的许多毛皮兽养殖场(户)都有一定程度的流行，但不少养殖者对该病认识不清，常误认为是疥螨引起，因而临床上治疗不得当，造成较长时间的流行和传染，甚至导致一部分感染兽死亡。随着我国养狐业的发展壮大，近年来的养殖量已突破1000万只，皮肤真菌病在疫病防控中显得越来越重要[3]。因此，对养殖狐貉聚集地的吉林大安地区进行了银黑狐皮肤病取样调查。银黑狐皮肤病病变主要发生在动物的背部、背腹部及四肢等处，形成近圆形的脱毛并形成癣斑，有的癣斑中央部开始痊愈长毛，而周围继续脱毛，呈现轮状癣斑，严重者蔓延全身大部分躯体，病貂精神萎靡不振、食欲降低、逐渐消瘦、贫血、生长发育迟缓。

在目前的检测体系中，真菌诊断仍然以传统的培养镜检为主，然而培养过程相当耗时，且时常遭遇无法培养的困难，因此，传统鉴定无法满足临床快速正确诊断的需求。近年来，有许多非培养式鉴定方法被研究开发来改善病患的诊疗[4]，宏基因组即生境中全部微小生物遗传物质的总和，它以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的。宏基因组学技术第一次使人类得以研究占环境中99%的不可培养的微生物种群，从而成为微生物研究的最前沿领域。

本研究应用宏基因组测序方式，对样本中所有真菌样本的内转录间隔区(ITS)进行序列测定和生物学统计，寻找出银黑狐真菌皮肤病致病性病原体以及研究其分子特征，为进一步开发出皮肤真菌病快速诊断试剂奠定基础。

1　材料与方法

1.1　病料样本

采自发病的银黑狐皮肤，以外科刀刮取病变部鳞屑和皮肤，用安瓶收集，4℃保存，运送到实验室。

1.2　试剂

E.Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA公司)；Qubit2.0 DNA检测试剂盒(Life Technologies公司)；TaqDNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)。

1.3　样本DNA的提取

使用磁珠法提取样本中的DNA，Qubit2.0检测DNA浓度，琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

1.4　PCR扩增

利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应应加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的ITS3-4通用引物：

ITS4引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNTCC TCCGCTTATTGATATGC；

TS-3-F引物：TGACTGGAGTTCCTTGGCACCC GAGAATTCCAGCATCGATGAAGAACGCAGC

以样品中提取的总DNA为模版，扩增16S rRNA V3-V4区基因。PCR采用20μL扩增体系：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、上游引物和下游引物各0.4μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、Template DNA 10ng，加灭菌水补至20μL。扩增条件：95℃预变性2min；25个循环，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 4s；72℃延伸10min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用QIA quickGelExtraction Kit回收纯化目的条带胶，将纯化产物送至上海生工生物有限公司，测序平台为Illumina Miseq。

1.5　宏基因组测序分析

生物信息分析主要包括分类操作单元(OUT)的生成、取样充足性分析、丰度和多样性分析、菌群间差异分析、假设验证分析、进化树分析等。修剪、去除序列中可能含有的模糊碱基，可得到供准确分析的优化序列。设定具有97%以上相似性的序列为1个OTU，特定的1个分类操作单元代表某一特定物种。在门和属2个分类水平上统计样品的物种丰度和多样性。

2　结果与分析

2.1　PCR扩增结果

PCR结束后，PCR产物进行琼脂糖电泳，在所有7个样本中均检测到了真菌目标PCR产物。这表明基因组DNA质量较好，可以满足正常的16S rRNA基因扩增，为后面的高通量测序实验提供基因组模板。

2.2　高通量测序数量

所有样品均得到覆盖深度极深的测序数据(表1)。在7个样品中除去冗余后的序列数达到17 537条～51 028条。其中，FoxJL组代表狐狸样本1～7。

表1高通量测序的数据量

Table 1 Datas of metagenomic sequencing

2.3　种分类水平下狐狸皮肤样本真菌群结构

在种分类水平进行狐狸皮肤样本真菌群结构分析，这些菌群在分类学上归属于16个种，其中，有18%(3/16)的种在种水平下不能被鉴定和分类。对丰度≥0.01%的种进行统计，<0.01%的计入其他。在已分类的种中，其中有11个种的丰度占总体数量的99%，这11个种包括苯黑末节皮真菌(Arthrodermabenhamiae)、波兰青霉菌(Penicilliumpolonicum)、分子孢子菌(Cladosporium)、红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、新型隐球菌(Cryptococcusmagnus)、球孢银耳菌(Tremellales)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、Davidiellatassiana、耐盐枝孢菌(Cladosporiumhalotolerans)、Candidarailenensis、茎点霉菌(Phomahuancayensis)、森林桑黄菌(Inonotussanghuang)、Cryptococcusadeliensis等。具体种分类水平分布见图2。其中，苯黑末节皮真菌为致病菌，在样品的测序频率中最高可占90%。

图2　基于OTU的菌群结构分析

2.4　系统发育树分析

将本研究中的真菌序列和数据库中的相关序列一起，建立基于ITS序列的系统发育树，结果显示，本研究中所获得的序列信息具有相当程度的多样性，主要分为3个大类，其中，苯黑末节皮真菌(Arthrodermabenhamiae)与发菌科(Trichocomaceae)拓扑分类学上接近，而发菌科为感染人皮肤的重要真菌，因此，本研究中狐狸表皮真菌极有可能是人兽共患性真菌。

3　讨论

真菌感染在临床上相当常见，不仅会感染表皮质层或附属结构，也会侵犯真皮、皮下组织，甚至是内脏器官或血液等循环系统。目前的资料显示，毛皮兽临床上的真菌感染以犬小孢子菌和毛癣菌为主[5]。对于临床上逐渐复杂且严重的真菌性感染，只有迅速而正确鉴定出感染菌种[6]才能采取有效的药物治疗[7]。

真菌是以DNA为遗传物质的真核生物，除细胞核之外，线粒体也具有DNA，真菌可存在单倍体或双倍体，而且部分菌丝也缺乏细胞核，因此，真菌DNA的分离纯化产量差异很大，也导致此方法在临床鉴定上的困难。尽管如此，DNA在宿主被感染的组织中仍可稳定存在并被分离。目前，可以从动物全血、血清和粪便中纯化出真菌DNA，但是最大的困扰在于缺乏标准有效的核酸提取手段[8，9]。宏基因组高通量测序作为第2代DNA测序技术，其敏感性大大提高。结合数据库和生物信息学，能非常便捷地检测和鉴定出真菌种类。

目前，已有多起人感染毛皮兽真菌引起皮肤病的报道[10，11]，但是至今为止，并未清楚其具体病原体。本研究应用高通量测序，首次鉴定出大安银黑狐皮肤真菌病的病原体。在实验过程中，宏基因组测序作为强有力地研究手段，显示出巨大地应用潜力，能检测出样本中几乎所有的微生物。

[1]王卫青,刘鹏.毛皮动物常见皮肤病及其防治措施[J].湖北畜牧兽医,2014,(2):38-39.

[2]张勇,董丽华,吴长强.毛皮动物的掉毛和脱毛原因及综合防治[J].山东畜牧兽医,2012,(5):84-85.

[3]范治斌,董海燕,尚学东,等.辽宁省当前毛皮动物疫病流行状况及对策[J].现代畜牧兽医,2014,(10):46-48.

[4]张卓,梁新江,李蓓,等.特种毛皮动物真菌性皮肤病主要的诊断技术[J].饲料博览,2016,(2):54.

[5]钱靖.犬小孢子菌生物学性状及基因分型研究[D].兰州:兰州大学,2008.

[6]蒋国琴.毛皮动物癣病、螨病、湿疹的鉴别诊断和治疗[J].畜牧市场,2007,(8):52.

[7]吴云飞.盐酸特比萘芬的安全性和抗真菌药物的敏感性及临床疗效试验[D].南京:南京农业大学,2012.

[8]孙姝,于闯,刘丽琼,等.宠物犬猫常见皮肤病及防治[J].吉林畜牧兽医,2014,(4):50-51.

[9]陈一.泰州地区犬常见皮肤病流行病学调查及防控对策[D].杨凌:西北农林科技大学,2014.

[10]赵靖波.当心毛皮动物的皮肤真菌病传染给人[J].特种经济动植物,2006,(5):46.

[11]侯志军,张智杰,刘伟石,等.毛皮动物饲养场饲养员感染貉源真菌病一例[J].黑龙江畜牧兽医,2010,20(10):61.