茶叶化学成分样品制备的优化方法

张晓卫（洛阳市质量技术监督检验测试中心，河南洛阳471003）



茶叶化学成分样品制备的优化方法

张晓卫
（洛阳市质量技术监督检验测试中心，河南洛阳471003）

摘要：以指纹识别要求为基础，结合1H NMR以及主成分分析（PCA）两种方法分别作为测试以及评估手段，深入研究了对茶叶中化学成分样品制备优化方法。以生物指纹为手段，对化学组分和样品体系多而复杂的特点进行识别，以主成分分析为手段综合分析了样品质控多方面的因素，最后对实验条件进行确立。在样品制备程序基础上，采取4种代表性茶叶分别展开预处理以及测试。实践结果表明，本文所述方法不仅稳定，而且可靠性较好，与1H NMR要求相吻合。本文中所提优化方法操作简单，即使样品体系复杂也同样适用。

关键词：茶叶；化学成分；样品制备；优化方法

在生物学研究领域，指纹技术发挥着不可替代的作用，随着该技术的不断完善，也逐渐得到了大家普遍关注。代谢组学在近年来的兴起为该技术继续发展提供了重要支撑。Fiehn等人在进行植物样品标准化处理上，将其代谢物做到了“全提取”生成1H NMR谱，将主成分分析法等方法结合进来，以此来分析所得1H NMR谱。本文以“代谢物指纹识别”作为研究思路进行筛选。1H NMR具有快速、获取内容丰富等特点，PCA能够对大量信息展开整体性分析。因此在本文研究中，引入此方法既简化了操作步骤，又保证了最大程序获取和利用内涵信息。

1　实验步骤

1.1仪器以及试剂的选择

核磁谱仪；数控超声波清洗器；天平；数据处理软件；氘代甲醇；重水；3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠；磷酸二氢钠/磷酸氢二钠重水缓冲溶液，pH值控制在7.4，取部分加入TSP-d4作内标基准试剂用。

1.2具体过程

根据参考资料以及多年工作经验，本次实验采用的预处理方法是超声提取。采用四个样品分别是晒青毛茶（编号为T1）、宁洱困芦山古茶（编号为T2）、普洱茶（编号为T3）以及人参乌龙茶（编号为T4）。分别取出4种茶叶，研磨成粉末并过筛处理；取定量粉末浸泡于配置好的溶剂中，经过一段时间的控温超声之后，将其冷却离心处理，在核磁管中加入400μL上清液，取10μL基准试剂加入其中待测。这样做能够使体系pH值保持恒定，并且能够提供内标参考峰。

1.3获取1H NMR谱

选取脉冲序列，其中谱宽设置为6000 Hz，弛豫延迟设置为2s，混合时间设置为150ms，采样点数32K，扫描次数为256次，得出1H NMR后，利用Fouier进行变换、相位以及基线校正，将甲基质子信号峰值位移定位成零，化学位移定标，整个实验步骤都在恒温状态下完成。

1.4PCA

该方法是一种数据线映射方法，实现了对多元变量数据的统计处理。它能够最大限度将原有信息保留下来，把样本从高维空间状态下映射到低维空间状态下。PCA思路：利用少量变量解释原始数据中包含的大量信息，对相关性较高的变量进行处理，转化成不相关或者独立新变量，我们所说的主成分指的就是这些新变量。PCA的本质就是数据降维。在实验中引用PCA，以此实现对1H NMR的数据分析，为设置实验条件提供科学依据。为了保证PCA与数据要求相符合，我们首先要处理1H NMR谱。具体操作方法如下：首先对甲基质子峰积分面积进行设定，为1；然后利用专业的数据处理软件，单位设置为20Hz，把1H NMR谱图划分为多个小区，每个小区均等，将各个小区相对积分面积值进行获取，对残留水峰区和残留质子峰区数据进行删除处理；再次对所得数据进行转换为ASC II文件，将其输出，通过EXCEL做归一化处理，并对数据格式进行转置。该步骤完成之后，输至PCA专业软件中进行分析，最终结果以“载荷图”和“得分图”体现出来。

2　结果分析

2.11H NMR谱图

为了便于进行PCA分析，需要进行指认归属的位移区段，对不同条件下样品的物质含量进行了考察，这样做的目的在于能够将最佳制备条件提取出来。首先有针对性地对T1提取物1H NMR谱指认，凭借核磁共振对部分信号进行了确证。

图1　1H NMR谱图

根据图1特征，将其划分为4个区段。通过对图1进行观察，我们能够观察到下列信息：I区只包含甲基质子信号，这样在进行后续处理时，就有了保证。Ⅱ区信号强度相对适中，分布也比较均匀，信号之间出现分离，以便于指认。出现的信号主要是饱和烷基质子。茶叶中包含的大量糖苷、咖啡因和糖等质子信号都体现在Ⅲ区中，通过图1我们可以看出，该区内的信号总体来说较强，具有严重的谱线重叠，该区中有很多信号不能直接指认。Ⅳ区信号非常分散，而且共振谱线之间的强度差异十分明显。在接下来的实验中发现，该区信号对茶叶品种极为敏感，容易识别的信号有氮杂环、芳香环、和烯烃等质子。

2.2优化提取条件

在设计预处理方法时，从四个方面进行了优化，分别是调整了溶剂的配比、样本量比例、提取温度和时间。具体步骤是将上述四个条件结合起来，分别获取四种茶叶的1H NMR谱图，依次进行预处理和PCA分析，得出分别对应的主成分得分图以及载荷图，共四组。在这里，由于篇幅限制不将图进行一一列举。通过得分图能够发现制备条件的变化对样本点分布产生了哪些影响。其分布取决于PC1、PC2得分。而得分受到位移区段的影响。这样一来，就能够得知制备条件的不同会对哪些成为提取量产生影响。具体制备条件如下：

第一，溶剂配比。提取剂极性取决于溶剂配比，对提取到的物质提取量多少也有着直接关系，以指纹谱形式反映出来。等量称取经研磨过筛处理的茶叶样本共10份，分别加入1000 μL以氘代甲醇和提取剂，提取剂体积分数从10％以每次增加10％为准，直至100％为止。在超声下进行30min提取，样本量比例为12。通过前文所述方法得出10个样品，对10样品依次编号。在第一、二主成分空间上将样品1H NMR谱图进行投影。

第二，提取剂的用量。提取剂用量对提取效率有很大的影响。以70％ 的MeDo为提取剂用量，在40℃超声条件下进行30min提取，然后进行筛选。对T1样本进行平行称取，共6份，每份重量控制在100mg。误差不超过0.1mg。依次加入提取剂，提取剂量从600μL以每次200μL递增，最高提取剂量为1600μL，共产生6个样品，依次进行编号。

第三，提取温度。温度控制在整样品的整个制备过程中非常重要。将经过研磨过筛处理的T1样本进行平衡称取，共6份，每份质量控制在83.3mg，误差不超过0.1mg。参照上一步骤加入提取剂，分别置于温度20℃、3O℃、40℃、50℃、60℃和65℃下，进行30min的超声提取。共产生6个样品，依次进行编号。

第四，提取时间。经过研磨过筛处理的T1样本进行平衡称取，共5份，每份质量控制在83.3mg，误差不超过0.1mg。参照上一步骤加入提取剂，置于温度为60℃的条件下进行下超声提取，提取时间从10min以每次10min递增，最长时间为50min，共产生5个样品，依次进行编号。

根据实验结果，得出以下分析：在上述4个条件中，样品最大的制备条件是提取剂的配比；然后是提取剂量。关于提取温度和时间，应当根据实际情况进行合理选择。通过对上述4个制备条件的综合分析，最终决定本次实验制备条件：提取剂是70％MeOD，提取剂用量是12，提取温度和时间分别是60℃、20min。

2.3分析样品

以前文所述4种茶叶作为样本，凭借指纹测试考察了的预处理方案的可行性。经过研磨过筛处理的4个样本进行平衡称取，共3份，每份质量控制在83.3mg，误差不超过0.1mg。样品数量为12，分别进行标记。每一个样品都要进行3次平行测量，一共得到了36张1H NMR谱图，经过转化之后，一共获取了36组样本。对全部样品进行PCA分析，并得到了投影判别图。发现4组样本数据点之间的离散非常明显，而且每一类样本都出现了聚类现象。

表1　4种茶叶样品离散因子表

由于上述测试所得到的效果非常好，因此，对预处理效果考察借助离散因子就可以体现出来。通过表1我们可以直观看出，除了T4样本以外，离散因子均不超过10，该样本虽然离散因子较大，但是也控制在了90左右。除此之外，根据表1能得出下列结论：（1）单一样本的聚集度较高，预处理方法的稳定性非常高，同时，具有良好的重现性；（2）两个样本的数据点之间呈现高度离散现象，即使T1和T2两个样本属于一种性质，与单一样本相比，离散分子的倍数超过33倍。由此可见，原始数据中含有能对样品差异进行充分反映的特征信息。

根据实验结果，得出本次预处理方法非常可靠的结论。在本次预处理方法下可能产生的偏差要远远小于样品自身内源差异。因此符合指纹技术要求。

3　结　语

本文以超声提取作为提取方法，这一方法在实验室研究中十分普遍。该方法不仅简单、便于操作，而且具有极高的推广价值，因此，对于普及指纹技术及其数据也是十分有利的。除此之外，在提取剂方面进行替换，本文所采用的提取剂不仅操作起来更为简单，而且对实验过程中由于转移导致的样品算是和污染做到了保证，同时对实验重现性也做到了有效保证。

参考文献

[1]赵蕊.欧阳捷.杜树山.耿珠峰.许美凤.邓志威.茶叶化学成分指纹识别中样品制备方法的优化[J].高等学校化学学报，2010（1）.

[2]马媛媛.在茶叶成分中提取咖啡因的试验方法及改进[J].科技展望，2015（25）.