中药活性成分复方对AD转基因模型小鼠海马Aβ的影响*

贺小平，董贤慧（.中国人民解放军第266医院，河北承德　067000；2.承德医学院人体解剖学教研室）

中药活性成分复方对AD转基因模型小鼠海马Aβ的影响*

贺小平1，董贤慧2△
（1.中国人民解放军第266医院，河北承德067000；2.承德医学院人体解剖学教研室）

目的:观察淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病（AD）APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠模型海马β淀粉样蛋白（Aβ）表达的影响。方法：6月龄雄性APPswe/PS1ΔE9双转基小鼠20只，随机分为模型组和复方组，6月龄雄性C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。用药三个月后，采用免疫组化法检测各组小鼠海马Aβ的表达情况。结果：与正常对照组相比，模型组Aβ蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，复方组Aβ蛋白表达明显降低（P＜0.05）。结论：应用淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以降低AD模型小鼠海马Aβ的表达，从而缓解AD中枢神经系统功能衰退。

阿尔茨海默病；淫羊藿；黄芪；葛根；β淀粉样蛋白

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是临床上常见的一种老年性痴呆综合症，病理特征主要是神经元间β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成老年斑[1]。中医认为AD发病是以肾虚精亏、气血不足为本，痰瘀互结、浊毒内生为标的本虚标实之证。根据中医“标本兼治”的治疗原则，治疗AD应补肾健脾、益气养血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其标[2]。为此，本课题组将淫羊藿、黄芪、葛根活性成分进行组方，探讨该复方对AD转基因动物模型海马组织Aβ的影响，旨在探讨中药防治AD的疗效机理，为研制治疗AD新的方药提供新思路，为临床推广应用提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物分组SPF级6月龄雄性APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠20只，随机分为模型组和复方组，每组10只小鼠。6月龄C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。

1.2实验动物干预复方组小鼠灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根提取的有效组分复方，以临床3倍用药量给药，淫羊藿苷120mg/kg、黄芪甲苷80mg/kg、葛根素80mg/kg体重给予小鼠灌胃，各组小鼠用药处理1次/d，连续给药3个月。模型组和正常对照组小鼠给予等量生理盐水灌胃，时间同复方组小鼠。

1.3取材小鼠用药结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，多聚甲醛经心脏灌流固定后断头取脑，4%多聚甲醛后固定24h，30%蔗糖溶液沉淀脑组织。完整脑组织使用冷冻切片机-25℃、20μm连续切片，-20℃冰箱保存。

1.4免疫组化法检测小鼠海马组织Aβ的表达每组10只小鼠，每只小鼠选取一张海马完整的冰冻切片进行免疫组织化学染色，46℃烤片2h，PBS洗3次，每次5min；体积分数3%的过氧化氢处理，山羊血清封闭；兔抗小鼠Aβ（1:500）4℃孵育过夜，山羊抗兔生物素化二抗37℃孵育15min，辣根酶标记链霉卵白素37℃孵育15min，DAB显色，光镜观察。每张切片选取3个视野（×400），显微成像系统拍照后，用Image-Pro Plus软件检测阳性产物的平均光密度值。

2　结果

正常对照组、模型组、复方组海马Aβ的表达（平均光密度值）分别为0.403±0.102、0.782±0.096、0.531±0.132。与正常对照组相比，模型组小鼠海马Aβ的表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，复方组小鼠海马Aβ的表达明显降低（P＜0.05）。

3　讨论

AD是常见的老年人慢性退行性神经系统疾病，目前其病因、发病机制还不是十分清楚，很大程度上制约了AD治疗药物的筛选。据统计，截止2005年全球有2430万人患痴呆，每年新增痴呆病例460万。这将对家庭以及社会造成越来越沉重的负担，因此，对AD的致病机理及预防治疗策略的研究显得尤其迫切。

AD的一项重要病理特征是脑内存在大量老年斑(SP)，SP的主要成分是含39-42个氨基酸残基的Aβ，是由Aβ前体蛋白APP降解所产生[3]。Aβ在脑内位于细胞外，主要以Aβ40和Aβ42两种形式存在，其中Aβ42虽含量低，但易于聚集为原纤维而沉积，从而形成弥漫性SP[4]。

在正常生理状态下，Aβ在大脑仅有极少量表达，低浓度的Aβ对未分化、不成熟的神经元有营养作用，但Aβ的正常生理作用还有待更深入的研究。在神经退行性AD大脑中Aβ异常表达，高浓度的Aβ对已分化的、成熟的神经元有毒性作用，其神经毒性涉及到复杂的分子机制。高浓度的Aβ同时会加速Aβ的生成，以致更多的Aβ沉积和扩大大脑炎症，甚至可能会使前脑基底部的胆碱能神经退化[5]。此外，Aβ自我积聚形成的各种寡聚体，也具有神经毒作用，可致正常突触功能受损。

临床研究发现，轻、中度AD患者在服用黄芪、淫羊藿、葛根等中药组成的益气养阴合剂3个月后，可改善和增强AD患者的智力[6]。以淫羊藿为君药的益智健脑颗粒也可有效提高AD患者的智力和记忆力，改善AD患者认知功能和日常生活自理能力[7]；以黄芪为君药的益智醒脑汤配合针灸治疗老年痴呆症也具有一定疗效；单独应用葛根的活性成分之一葛根素对AD患者也具有一定的临床治疗效果。本研究发现，应用淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方的小鼠，海马Aβ的表达明显低于AD模型小鼠，说明淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可有效缓解AD模型小鼠因Aβ沉积所造成的神经系统功能损害。

中药具有辨证施治的特性和取材方便、毒性较小的优点，但由于中药的药效物质基础不够明确、作用机制尚不十分清楚、药物制剂质量可控性差等缺点，至今难以走入国际市场。鉴于此，在明确中药疗效和药理作用的基础上，从中药中分离药效物质清楚的活性成分和药效物质基本清楚并体现中药整合作用特点的成分配伍，可能为AD的治疗带来新的希望[8]。

本课题组将淫羊藿、黄芪、葛根活性成分进行组方，三药合用，可共起滋补肝肾、补脾养血，活血化瘀、清热解毒、健脑益智之功。中药是我国的传统瑰宝，有着上千年的历史，但是传统中药成分复杂，药效不稳定，且质量难以控制[9]。本研究采用中药的有效成分进行组方，既克服了传统中药方剂成分复杂、药效不稳定、质量难以控制的缺点，又继承了传统中药方剂多成分、多靶点、多效性的优点，对防治AD有着良好的市场前景。

[1]Zhang J, Zhen YF, Pu-Βu-Ci-Ren, et al. Salidroside attenuates beta amyloid-induced cognitive deficits via modulating oxidative stress and inflammatory mediators in rat hippocampus[J]. Βehav Βrain Res, 2013, 244(1)∶ 70-81.

[2]赵永辰，秦微，陈淑霞，等.老年轻度认知功能障碍的中医研究现状[J].中华中医药杂志，2014，29(11)：3496-3498.

[3]Prakash A, Medhi Β, Chopra K. Granulocyte colony stimulating factor (GCSF) improves memory and neurobehavior in an amyloidβ induced experimental model of Alzheimer’s disease[J]. Pharmacol Βiochem Βehav, 2013, 110∶ 46-57.

[4]Galante D, Corsaro A, Florio T, et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids[J]. Int J Βiochem Cell Βiol, 2012, 44(11)∶2085-2093.

[5]Suo WZ, Li L. Dysfunction of G protein-coupled receptor kinases in Alzheimer’s disease[J]. Scientific World Journal,2010,10∶1667-1678.

[6]李立新，孙丽萍，尉继伟，等.益气养阴合剂加减辨证治疗老年性痴呆[J].中国临床康复，2005，9(16)：93-94.

[7]Delacourte A, Sergeant N, Champain D, et al. Nonoverlapping but synergetic tau and amyloid precursor protein pathologies in sporadic Alzheimer’s disease[J]. Neurology, 2002, 59(3)∶ 398-407.

[8]Lue LF, Kuo YM, Roher AE, et al. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer’s disease[J]. Am J Pathol, 1999,155(3)∶853-862.

[9]杨鸣华，刘祎，孔令义.基于中药有效单体成分的新药研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2016，18(3)：329-336

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

EFFECTS OF EFFECTIVE FRACTION OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE ON AΒ EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF TRANSGENIC MOUSE MODEL OF ALZHEIMER’S DISEASE

HE Xiao-ping, DONG Xian-hui
(The 266 Hospital of Chinese PLA, Hebei Chengde 067000, China)

Objective∶ To observe the effects of effective fraction of Epimedium, Astragalus, Radix Puerariae on Aβ expression in hippocampus of APP/PS1 double transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Methods: 20 male APPswe/ PS1ΔE9double transgenic mice aged 6 months were equally and randomly assigned to model and compound group. An additional 10 6-month-old C57ΒL/6J mice served as normal control group. Immunohistochemical stain was used to detect the Aβ expression in hippocampus of mice in each group 3 months after medication. Results: Compared with normal control group, the Aβ expression in hippocampus of mice in model group increased obviously (P＜0.05). Compared with model group, theAβ expression in hippocampus of mice in compound group declined obviously (P＜0.05). Conclusions: The effective fraction of Epimedium, Astragalus, Radix Puerariae can down regulate Aβ expression in hippocampus of Alzheimer’s disease mice model, so to improve impairment of central nervous system of Alzheimer’s disease.

Alzheimer’s disease; Epimedium; Astragalus; Radix Puerariae; Aβ

R285

A

1004-6879（2016）06-0455-03

* 承德市科技局资助项目（201601A022），河北省重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助

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（2016-05-11）