党参、甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移多胺信号通路的影响

李茹柳，陶玉珠，曾　丹，赵世清，林传权，陈蔚文

(1.广州中医药大学脾胃研究所，广东 广州　510405；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州　510006)

党参、甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移多胺信号通路的影响

李茹柳1，陶玉珠1，曾丹1，赵世清2，林传权1，陈蔚文1

(1.广州中医药大学脾胃研究所，广东 广州510405；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州510006)

中国图书分类号：R-332；R284.1；R322.45；R329.24；R916.4

摘要：目的观察益气健脾中药党参、甘草的糖提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移过程多胺介导钾通道激活信号通路的影响，探讨党参、甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法在IEC-6细胞迁移模型上，于正常或抑制多胺(加入DFMO)时，观察党参、甘草糖提取物对该信号通路的作用：(1)Western blot检测钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达；(2)流式细胞仪检测细胞膜电位；(3)激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+水平；(4)Western blot检测Ca2+下游指标RhoA蛋白表达。结果党参、甘草糖提取物在细胞迁移过程可以: (1)提高Kv1.1蛋白表达水平，改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达下降；(2)提高细胞膜电位超极化水平，逆转DFMO所致细胞膜电位去极化；(3)提高细胞内Ca2+水平，党参糖提取物可逆转DFMO所致Ca2+水平降低；(4)提高RhoA蛋白表达水平，改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。结论党参、甘草糖提取物促进IEC-6细胞迁移的作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关。

关键词：党参；甘草；糖提取物；小肠上皮细胞；迁移；作用机制

胃肠黏膜损伤修复包括细胞迁移、分化、增殖等过程，其中细胞迁移是其重要步骤，尤其在早期整复阶段[1]。益气健脾中药能促进胃肠黏膜损伤修复[2]，但其作用机制尚不清楚。本课题组近年在小肠上皮(IEC-6)细胞的研究发现，益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草的提取物能促进细胞迁移，作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关[3-11]，其中对党参糖提取物(下文图表中简称CSE)、甘草糖提取物(下文图表中简称GSE)的研究表明，二者均可促进IEC-6细胞迁移，逆转DFMO(多胺合成抑制剂)所致的细胞迁移抑制，提高细胞迁移过程细胞内多胺(精脒)含量，逆转DFMO所致的精脒含量降低[5-6]；提示其促进细胞迁移的作用与增加细胞内多胺含量有关，为进一步探讨党参、甘草糖提取物促进细胞迁移的作用机制，本文观察其对多胺介导钾通道激活信号通路相关指标的影响，为党参、甘草胃肠黏膜损伤修复作用机制研究提供参考。

1材料

1.1药材党参药材为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf的干燥根；甘草药材为豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根茎，由广州中医药大学中药鉴定教研室童家赟讲师鉴定。

1.2试剂高糖DMEM(Cat.No.12800-017)、胎牛血清(Cat.No.10099-141)、青-链霉素(Cat.No.15140-122)，均为Gibco公司产品。精脒(spermidine，SPD，Cas.No.124-20-9，Cat.No.85558，分子质量145.25)、二氟甲基鸟氨酸(α-difluoromethylornithine，DFMO，Cas.No.96020-91-6，Cat.No.288500-25MG，分子量236.7)，美国Calbiochem公司产品；胰酶(1 ∶250，Cas.No.9002-07-7，Cat.No.0458-250G)，美国Amresco公司产品；蛋白提取试剂盒(Cat.No.269-500)，美国Biovion公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat.No.BP312)，南京碧波生物科技有限公司产品；Kv1.1一抗为多克隆兔抗(Cat.No.ab32433)，RhoA一抗为多克隆兔抗(Cat.No.ab68826)，均为英国Abcam公司产品；GAPDH一抗为多克隆兔抗(Cat. No.10494-1-AP)，美国Proteintech公司产品；HRP标记羊抗兔二抗(Cat.No.EO30120-01)，美国EarthOx公司产品；ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒(Cat.No.CW0049)，北京康为世纪生物科技有限公司产品；牛血清白蛋白(Cat. No.738323)，Roche公司产品；脱脂奶粉(Cat.No.Q/NYLB 0039S)，伊利公司产品；膜电位荧光探针DiBAC4(3)(Cat.No.61011，Lot.No.10D0819)，美国Biotium公司产品。

1.3仪器Smart specphus核酸蛋白测定仪，iMark酶标仪，ChemiDoc XRS化学发光成像系统，均为美国Bio-Rad公司产品；FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司产品；SP2型激光共聚焦显微镜，德国Leica公司产品；激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿(35 mm×12 mm)，丹麦NUNC公司产品；3111型CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司产品；AUW120D型分析天平，日本岛津公司产品。

1.4细胞IEC-6细胞(大鼠小肠隐窝上皮细胞)，购自ATCC(American Type Culture Collection)，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325。

2方法

2.1党参和甘草糖提取物制备党参、甘草糖提取物制备：称取党参或甘草饮片200 g，石油醚回流提取1 h。药渣挥干溶剂后，用体积分数为0.80的乙醇回流提取2次，每次1 h；药渣再用蒸馏水回流提取2次，每次1 h，合并2次水提液，减压浓缩至浓度为含药材0.5 kg·L-1；浓缩液加无水乙醇至乙醇体积分数为0.80，4℃静置过夜，以布氏漏斗加滤纸抽滤，去上清液，沉淀物加水溶解，再加无水乙醇使乙醇体积分数为0.80后，沉淀过夜，重复3次；所得沉淀物加纯水溶解成水溶液，以Sevage试剂(氯仿 ∶正丁醇=5 ∶1)萃取，取上层水相过大孔树脂，以蒸馏水洗脱，直至收集的洗脱液与5倍量体积分数为0.95的乙醇混合不产生浑浊，洗脱液加无水乙醇至乙醇体积分数为0.80，所得沉淀物分别用体积分数为0.95的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，4℃保存。使用时加PBS配制成5 g·L-1党参或甘草糖提取物溶液，0.22 μm滤膜过滤。苯酚-硫酸法以分光光度计测得党参、甘草糖提取物平均含量(以葡萄糖计)分别为41.0%和49.3%。

2.2Western blot法检测Kv1.1、RhoA蛋白表达细胞培养及给药方法：细胞以4×108·L-1，每孔2 mL接种于6孔板，DMEM培养液含10%胎牛血清(FBS)、10 mg·L-1胰岛素、100 kU·L-1青霉素-链霉素，5%CO2，95%空气，饱和湿度下37℃培养24 h，用刻刀沿6孔板底部中央轻轻划一直线划痕，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1，在5%CO2，95%空气，饱和湿度下37℃培养24 h。

总蛋白提取及测定：细胞培养24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗细胞表面2次，加适量PBS，细胞刮刀轻轻将细胞从壁上完全刮下，将含有细胞的PBS液收集到5mL离心管，离心后收集细胞，提取总蛋白。总蛋白少量用于蛋白浓度测定，其余予5×蛋白上样缓冲液以4 ∶1比例混匀，100℃水浴煮沸5 min使蛋白变性，置冰上5 min，然后10 000 r·min-1离心1 min，-20℃分装保存。蛋白浓度测定按BCA试剂盒说明书操作。

Western blot法操作：蛋白上样量为每孔20 μg，SDS-PAGE凝胶电泳(起始电压60 V，条带到达分离胶后调至120 V)，蛋白转移至PVDF膜(转膜电流300 mA，时间1 h)。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭，分别用一抗Kv1.1、RhoA(均1 ∶1 000稀释)孵育过夜，洗膜，二抗(1 ∶10 000稀释)孵育2 h，洗膜，ECL法显色；X线片曝光条带并显影定影，化学发光成像仪Image J图像处理软件画图工具圈起条带，所得mean值即各条带的平均灰度值。比较各组Kv1.1/GAPDH或RhoA/GAPDH平均灰度比值。

2.3流式细胞仪检测细胞膜电位(Em)[12]细胞培养及给药方法：细胞生长至80%~90%，消化细胞制作单细胞悬液；以4×108·L-1，每孔2 mL接种于6孔板，37℃、5%CO2，饱和湿度培养24 h，用1 mL移液器吸头在6孔板底部中央轻轻划一个“十”字划痕，PBS冲洗细胞表面3次，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1，每组3个复孔，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养。

细胞悬液制备及荧光标记：加入受试药后培养12 h，HBSS(D-Hanks缓冲液)冲洗细胞2次，加入胰酶消化，细胞回缩变圆后，加等量DMEM终止消化；3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入HBSS重悬；再离心，弃上清液，每个离心管(6孔板每孔细胞收集于1个离心管)加入含1 μmol·L-1DiBAC4(3)溶液的HBSS 1 mL。CO2培养箱中避光孵育8 min，此过程每2 min摇晃混匀1次，使染料与细胞充分结合。孵育完毕，3 000 r·min-1离心5 min；弃上清液，加入适量HBSS重悬，离心，转入流式管，上流式细胞仪检测；激发波长488 nm，发射波长520 nm，每管检测10 000个细胞，同时设不标记的空白细胞管用于调零。比较各组的平均荧光强度(mean值)进行统计。

DiBAC4(3)是细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，根据其在细胞内外的重新分布，可无损伤地测定细胞膜电位的变化。DiBAC4(3)本身无荧光，当进入细胞与胞质内的蛋白质结合后发出荧光。DiBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强时，表明膜电位负值减小，膜去极化；反之，细胞内荧光强度降低则表示细胞膜超极化。

2.4激光共聚焦显微镜检测细胞Ca2+水平[13]细胞培养及给药方法：细胞生长至80%~90%，消化细胞制作单细胞悬液；以4×108·L-1，每孔2 mL接种于激光共聚焦培养皿中，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养24 h，用1 mL移液器吸头沿底部中央轻轻划一直线划痕，PBS冲洗细胞表面3次，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1；每组2个复孔，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养。

荧光物质孵育：各组加入受试药培养12 h，HBSS冲洗2次，每个培养皿加入终浓度为5 μmol·L-1的Fluo-3/AM探针装载液1 mL，CO2培养箱中避光孵育30 min，吸弃探针装载液，HBSS冲洗细胞3次，加入适量HBSS，CO2培养箱中避光孵育20 min。激光共聚焦显微镜下放大200倍进行荧光图片采集，每个培养皿选择划痕附近迁移细胞6个视野采集荧光图片。

平均荧光强度计算：IPP软件将图片转成灰度图片，测量累积光密度值(IOD)与area。每张图片的IOD即为其总荧光强度，再以显微镜数出每张图片的细胞个数；IOD除以细胞总数，即为单张图片每个细胞的平均荧光强度值。

3结果

3.1党参、甘草糖提取物对Kv1.1蛋白表达的影响

3.1.1对Kv1.1蛋白表达的影响(无DFMO负荷)Fig 1蛋白条带灰度值比较，党参糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)与空白组比较均P<0.01；甘草糖提取物50 mg·L-1组与空白组比较P<0.01，甘草糖提取物100 mg·L-1组与空白组比较P<0.05；表明党参、甘草糖提取物能提高细胞迁移过程钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达。

3.1.2DFMO负荷时对Kv1.1蛋白表达的影响Fig 2蛋白条带结果可见，DFMO能抑制Kv1.1蛋白表达，党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达抑制。

Fig 1　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

1：CSE100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4：spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1

Fig 2　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+ CSE 100 mg·L-1；3：Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5：DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6： DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1

3.2党参、甘草糖提取物对细胞膜电位的影响

3.2.1对细胞膜电位的影响(无DFMO负荷)Fig 3和Tab 1结果显示，党参、甘草糖提取物组(50 mg·L-1)细胞的平均荧光强度低于空白组(P<0.01)，表明其细胞膜超极化水平高于空白组，Em增加。表明党参、甘草糖提取物可增加细胞膜超极化水平，提高细胞膜电位。

Tab 1　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

***P<0.01vscontrol

3.2.2DFMO负荷时对细胞膜电位的影响Tab 2结果显示，DFMO模型组细胞平均荧光强度高于空白组(P<0.05)，表明DFMO组细胞膜去极化水平高于空白组，Em降低；党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆转DFMO所致细胞膜去极化(与模型组比较P<0.05或P<0.01)。

3.3党参、甘草糖提取物对细胞Ca2+水平的影响

3.3.1对细胞Ca2+水平的影响(无DFMO负荷)Fig 4和Tab 3结果显示，党参、甘草糖提取物(50 mg·L-1或100 mg·L-1)能提高细胞迁移过程细胞Ca2+水平(与空白组比较P<0.01)。

Fig 3　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on Em

A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1

Tab 2　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

**P<0.05vscontrol；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01vsDFMO

Tab 3　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

***P<0.01vscontrol

3.3.2DFMO负荷时对细胞Ca2+水平的影响Tab 4结果显示，DFMO负荷时，细胞Ca2+水平降低(模型组与空白组比较P<0.01)；党参糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆转DFMO所致Ca2+水平降低(与模型组比较P<0.01)。

Tab 4　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

***P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsDFMO

3.4党参、甘草糖提取物对RhoA蛋白表达的影响

3.4.1对RhoA蛋白表达的影响(无DFMO负荷)Fig 5蛋白条带灰度值比较，党参、甘草糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)与空白组比较均P<0.01；表明党参、甘草糖提取物能提高细胞迁移过程RhoA蛋白表达。

3.4.2党参和甘草糖提取物对DFMO负荷下RhoA蛋白表达的影响Fig 6蛋白条带结果可见，DFMO能抑制RhoA蛋白表达，党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。

4讨论

党参性味甘平，归脾、肺经；功能健脾益肺，养血生津；用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足，足，面色萎黄，心悸气短，津伤口渴，内热消渴。甘草性味甘平，归心、肺、脾、胃经，功能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药；用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢痉急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[14]。党参、甘草是益气健脾著名方剂四君子汤的组成药物，临床和实验研究表明，四君子汤有促进胃肠黏膜损伤修复的作用[15]。

Fig 4　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on [Ca2+]cyt(200×)

A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1

Fig 5　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

1： CSE 100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4： Spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1

Fig 6　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts

1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+CSE 100 mg·L-1；3： Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5： DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6：DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1

小肠上皮损伤后整复阶段，多胺增加则增强了钾通道蛋白的表达，K+外流，导致细胞膜超极化，增强了Ca2+内流驱动力而提高了细胞内Ca2+水平，后者增加了RhoA活性，使Rho-kinase激活，增加了肌球蛋白轻链磷酸化，从而刺激了应力纤维形成和细胞迁移；相反，消除了细胞内多胺(加入DFMO)，则下调了钾通道活性，减少了细胞内Ca2+，使RhoA/Rho-kinse信号通路不激活，减少了肌球蛋白轻链磷酸化，从而抑制了细胞迁移[1]。二氟甲基鸟氨酸(DFMO)是多胺合成的限速酶——鸟氨酸脱羧酶的特异性抑制剂，本课题组前期研究表明，党参、甘草糖提取物可促进小肠上皮(IEC-6)细胞迁移，逆转DFMO所致的细胞迁移抑制，提高细胞迁移过程多胺(精脒)含量，逆转DFMO所致的精脒含量降低[5-6]。本文在此基础上，观察党参糖提取物、甘草糖提取物对IEC-6细胞迁移多胺介导钾通道激活信号通路的影响。结果显示二者在细胞迁移过程可以：提高钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达水平，改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达下降；提高细胞膜电位超极化水平，逆转DFMO所致细胞膜电位去极化；提高细胞内Ca2+水平，其中党参糖提取物能逆转DFMO所致Ca2+水平降低；提高Ca2+下游指标RhoA蛋白表达水平，改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。本课题组的另一研究表明，党参、甘草糖提取物可逆转钾通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)所致的细胞迁移抑制及细胞膜去极化[16-17]。结合前期党参、甘草糖提取物在IEC-6细胞的实验结果[5-6]，表明其促进IEC-6细胞迁移的作用机制，与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关；此研究结果也与本课题组在益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草提取物的作用类似[3-11]。提示对细胞迁移多胺介导钾通道激活信号通路的影响，可能是益气健脾中药促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制之一。

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Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on polyamine-dependent signaling pathway during cell migration in IEC-6

LI Ru-liu1, TAO Yu-zhu1, ZENG Dan1, ZHAO Shi-qing2, LIN Chuan-quan1, CHEN Wei-wen1

(1.PiweiInstituteofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China;2.SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:AimsTo observe the effect of saccharide extracts of Yiqijianpi herb Codonopsis and Glycyrrhizae on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway during cell migration and to investigate their mechanism of promoting restoration in gastrointestinal mucosal injuries. MethodThe study was based on IEC-6 cell migration model. While in a normal polyamine level or polyamine was inhibited by DFMO, the effect of Codonopsis saccharide extracts and Glycyrrhizae saccharide extracts on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway during cell migration was observed. (1) K+channel protein Kv1.1 was determined by Western blot. (2)Membrane potential was measured by Flow Cytometer. (3) Laser scanning confocal microscope was used for measuring [Ca2+]cyt. (4) The expression of RhoA, which is Ca2+downstream protein, was determined by Western blot. ResultsDuring cell migration, Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts could: (1) improve the expression of Kv1.1 protein and ameliorate the decrease of kv1.1 protein expression by DFMO; (2) increase membrane hyperpolarization and reverse membrane depolarization resulted by DFMO; (3) improve intracellular [Ca2+]cyt, while Codonopsis could reverse the decrease of [Ca2+]cyt caused by DFMO; (4) improve the expression of RhoA protein, reversing its decline caused by DFMO. ConclusionCodonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts can promote cell migration in IEC-6 cell, which is correlated with their effect on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway.

Key words:Codonopsis; Glycyrrhizae; saccharide extracts; intestinal epithelial cell; migration, mechanism of action

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0245-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.019

作者简介：李茹柳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：益气健脾中药作用机制，通讯作者，Tel：020-36585444；E-mail：lrl@gzucm.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 30772753，81173254)；中央财政支持地方高校发展专项资金项目“重大难治性脾胃病防治协同创新平台”[财教(2013)338号]；华南中医药协同创新中心—中医药防治脾胃病、脑病创新研究团队项目(No E1-KFD015141K03)

收稿日期:2015-10-20,修回日期:2015-11-09

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.038.html网络出版地址：2016-1-25 15:57