先天性心脏病合并肺动脉高压患者的心肌纤维化评价

冯迎军

(郑州市儿童医院，郑州450000)



先天性心脏病合并肺动脉高压患者的心肌纤维化评价

冯迎军

(郑州市儿童医院，郑州450000)

摘要：目的探讨先天性心脏病合并肺动脉高压患者的心肌纤维化情况。方法选择先天性心脏病患儿64例，其中未合并肺动脉高压32例(A组)，合并肺动脉高压32例(B组)。采用RT-PCR法检测心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1) mRNA表达。结果A组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量分别为1.95±0.34、1.19±0.37，B组分别为2.95±0.21、1.88±0.54；A组CTGF、TGF-β1mRNA的相对表达量分别为0.80±0.27、0.44±0.20，B组分别为1.31±0.50、0.89±0.48；B组心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF、TGF-β1mRNA表达均高于A组(P均<0.05)。CTGF表达与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达呈正相关(r分别为0.427、0.513，P均<0.05)；TGF-β1表达与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达呈正相关(r分别为0.471、0.504，P均<0.05)。结论先天性心脏病合并肺动脉高压患者心肌纤维化程度升高，检测心肌组织CTGF、TGF-β1表达可评估心肌纤维化程度。

关键词：先天性心脏病；肺动脉高压；心肌纤维化；结缔组织生长因；转化生长因子-β1

肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压≥25 mmHg的一组临床病理生理综合征[1]。结缔组织生长因子(CTGF)是一种富含半胱氨酸的分泌肽，与血管、皮肤、心脏、肾脏、胰腺、肺及肝脏等在内的许多组织器官纤维化发生发展密切相关[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能[3]。本研究检测先天性心脏病合并肺动脉高压患者心肌组织CTGF、TGF-β1表达情况，并探讨其与心肌纤维化程度的关系。

1资料与方法

1.1临床资料2013年8月~2015年6月本院收治先天性心脏病患儿64例，均经体检、超声心动图检查确诊，并排除其他合并心脏畸形、心力衰竭、需行手术治疗的瓣膜病变以及术前服用过钙离子拮抗剂、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂者。其中未合并肺动脉高压32例(A组)，男17例、女15例，年龄2~12(7.0±2.6)岁，体质量12~45(29.61±8.15)kg；孔型房间隔缺损(ASD)15例、室间隔缺损(VSD)10例、动脉导管未闭(PDA)7例。合并肺动脉高压32例(B组)，男18例、女14例，年龄2~11(7.2±2.4)岁，体质量10~43(29.04±8.20)kg；孔型ASD 16例、VSD 10例、PDA 6例。两组性别构成、年龄、体质量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

1.2心肌标本采集患儿入院后于心外科体外循环开始后、插入上腔静脉引流管前，切取右心耳心肌组织，放入冰冻生理盐水中，去掉血液及脂肪后吸干水分，置于液氮中保存，后移至-70 ℃冰箱中保存，待检。

1.3心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF、TGF-β1表达检测

1.3.1提取总RNA取心肌组织加入液氮研磨成粉末状，加入1 mL Trizal试剂，放置10 min；将溶剂转移至无酶EP管，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min；将上清液移至无酶EP管，加200 μL氯仿，振荡、混匀，冰上孵育15 min，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取最上层无色水相置无酶EP管，加500 μL冰浴异丙醇，颠倒振荡、混匀，冰浴中静置10 min，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清液，用1 mL冰浴的75%乙醇洗涤RNA沉淀，于4 ℃、12 000 r/min离心5 min,重复2次；弃掉上清液，晾干RNA；30 mL DEPC处理水溶解RNA；取2 μL RNA用紫外分光光度计确定其纯度和浓度，取5 μL RNA通过琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。

1.3.2逆转录及PCR扩增总RNR逆转录合成cDNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。将0.2 mL无RNA酶PCR管置冰上，加入2×PCR Master Mix 12.5 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 0.5 μL，Water muclease-free 11 μL。Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF、TGF-β1引物由上海生物工程有限公司合成，扩增条件：94 ℃ 预变性5 min、94 ℃变性 30 s、60 ℃复性40 s、60 ℃延伸40 s、94 ℃ 最后延伸5 min，重复35个循环，产物于4 ℃保存。

1.3.3mRNA表达检测取PCR产物10 μL，2.0%琼脂糖凝胶于120 V电压下电泳30 min后采用凝胶成像系统观察，采用Quantity one软件读取灰度值，用比值作为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF、TGF-β1mRNA的表达水平，结果做半定量分析。

2结果

2.1两组心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达两组于216、 347、376 bp处见扩增产物条带，分别为β-actin、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的编码基因片段。B组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量高于A组(P均<0.05)。见表1。

表1　两组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达比较

2.2两组心肌组织中CTGF、TGF-β1mRNA表达两组于216、 477、186 bp处见扩增产物条带，分别为β-actin、CTGF、TGF-β1的编码基因片段。B组CTGF、TGF-β1mRNA相对表达量高于A组(P均<0.05)。见表2。

表2　两组CTGF、TGF-β1 mRNA表达比较

2.3CTGF、TGF-β1表达与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达的关系 经直线相关分析显示，CTGF表达与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原呈正相关(r分别为0.427、0.513，P均<0.05)；TGF-β1表达与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原呈正相关(r分别为0.471、0.504，P均<0.05)。

3讨论

肺动脉高压是先天性心脏病常见并发症，也是是心血管外科最严重的并发症之一[4，5]。如果能早期诊断及时治疗，可以使20%的患者病情稳定，甚至痊愈。观察先天性心脏病合并肺动脉高压患者的心肌纤维化情况，可对其病情严重程度进行评价，对临床诊治有一定指导意义。心肌纤维化是由中重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄引起心肌纤维持续性和(或)反复加重的心肌缺血缺氧所产生的结果，心脏体积增大，质量增加，心腔扩张；心壁厚度可能正常，伴有多灶性白色纤维条索或条块，甚至透壁性瘢痕；心内膜增厚并失去正常光泽，有时可见机化的附壁性血栓。光镜下可见广泛性、多灶性心肌纤维化，伴邻近心肌纤维萎缩和(或)肥大，常有部分心肌纤维肌质空泡化，尤以内膜下区明显。临床上可表现为心律失常或心力衰竭[6]。心肌纤维化主要表现为心肌各种胶原比例失调，Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成与降解的平衡破坏，使心肌间质及血管周围Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维过度沉积，导致心肌代谢异常、僵硬度增高、舒缩功能障碍[7]。本研究中，B组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量高于A组，提示先天性心脏病合并肺动脉高压患者存在心肌纤维化。

CTGF所在家族成员在氨基酸序列上有着高度的同源性，其蛋白质结构中包括N末端的胰岛素样生长因子结合区、血管性假血友病因子C型重复区、血小板反应蛋白1型重复区以及富含半胱氨酸的C末端结合区四个主要结构区域[8]。热娜·艾山等[9]研究认为，超声背向散射测定结合CTGF、Ⅰ型前胶原氨基端肽可显示持续性房颤患者的心房肌纤维化程度。李勇等[10]对急性ST段抬高型心肌梗死患者血清CTGF表达进行检测，结果显示心肌梗死组患者发病后各时间段血清CTGF蛋白浓度较心绞痛组高。心肌梗死组患者发病后血清CTGF蛋白浓度第1~7天逐渐升高，第7天时血清CTGF蛋白浓度与CK-MB酶活性峰值呈正相关。认为CTGF浓度对预测心肌梗死面积有一定的临床意义。本研究中B组CTGF mRNA的相对表达量高于A组，进一步证实先天性心脏病合并肺动脉高压患者存在心肌纤维化。

近年来发现，TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。一般来说，TGF-β对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用[11]。TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3功能相似。韩秀霞等[12]研究显示，慢性肾脏病患者血清TGF-β1水平高于正常健康人，且血清TGF-β1与室间隔厚度、左室后壁厚度、左室质量均呈正相关，与左室射血分数、 左室短轴缩短率、 心脏指数均呈负相关，可见血清TGF-β1水平可反映心肌肥厚情况及心功能水平。马洪亮等[13]研究显示，先天性心脏病伴重度肺动脉高压患儿血清VEGF及TGF-β1浓度高于轻度肺动脉高压和无肺动脉高压患儿，肺动脉收缩压与血清VEGF及TGF-β1水平呈正相关。提示VEGF和TGF-β1水平对预测肺动脉高压发生、发展的动态变化有一定临床价值。本研究B组CTGF、TGF-β1mRNA的相对表达量显著高于A组，提示先天性心脏病合并肺动脉高压患者心肌纤维化程度高于未合并肺动脉高压患者。直线相关分析显示，CTGF、 TGF-β1表达水平与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达均呈正相关关系，表明对心肌组织中CTGF、TGF-β1水平进行检测可评估心肌纤维化程度。

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(收稿日期：2015-09-04)

中图分类号：R541.1

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)05-0032-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.012