羧胺三唑对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用

朱　蕾，李　娟，郭　磊，于晓丽，武丹威，陈　玮，陈　晨，杜晓婉，张德昌，叶菜英

中国医学科学院　北京协和医学院　基础医学研究所药理系，北京 100005



·论著·

羧胺三唑对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用

朱蕾，李娟，郭磊，于晓丽，武丹威，陈玮，陈晨，杜晓婉，张德昌，叶菜英

中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所药理系，北京 100005

叶菜英电话：010- 65597159，电子邮件：caiyingye@126.com

摘要：目的研究羧胺三唑(CAI)对大鼠佐剂性关节炎(AA)的治疗作用。方法大鼠随机分为正常对照组、溶剂对照组(聚乙二醇 400组和生理盐水组)、CAI 3个剂量(10、20、40 mg/kg)组和阳性药地塞米松(Dex)组。采用弗氏完全佐剂诱导大鼠AA模型，进行关节炎评分、后肢X线摄片和组织病理学检查，检测大鼠炎症足爪组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)- 1β和IL- 6水平。结果CAI能明显降低AA大鼠的关节炎指数，促进其体重的恢复，改善AA大鼠后肢关节放射学和组织病理学损伤(P<0.05或P<0.01)。CAI低、中、高剂量组和Dex组可显著降低TNF-α和IL- 1β水平，CAI中、高剂量和Dex可显著降低IL- 6水平(P<0.05或P<0.01)。结论CAI对AA大鼠具有明显的治疗作用，其作用机制可能与其降低炎症部位的促炎细胞因子有关。

关键词：羧胺三唑；佐剂性关节炎；细胞因子

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：49-54

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性和系统性的自身免疫性疾病，其主要病理改变是增生性滑膜炎，继而引起软骨和骨组织破坏，最终导致关节畸形和功能障碍。由于RA的病因和发病机制迄今未明，目前临床尚无理想的治疗方法[1]。羧胺三唑(carboxyamidotriazole，CAI)是一种非细胞毒类的抗癌药物，能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖和侵袭，抑制内皮细胞增生和肿瘤血管生成[2- 3]。本课题组以往研究发现，CAI不仅具有抗癌作用，还具有较强的抗炎镇痛作用[4- 5]，但其能否用于自身免疫性疾病如RA的治疗尚未见文献报道。本课题组前期研究结果显示，CAI能够减轻RA实验模型——大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型的足爪肿胀[4]，在此基础上，本研究观察了CAI对AA大鼠的治疗作用，探讨了其可能的作用机制。

材料和方法

试剂CAI由中国医学科学院药物研究所合成，以聚乙二醇400(polyethylene glycol 400，PEG 400)配制成所需浓度。地塞米松(dexamethasone，Dex)购自天津金耀氨基酸有限公司，用生理盐水(normal sodium，NS)稀释至所需浓度。卡介苗(北京生物制品研究所)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)- 1β和IL- 6 ELISA检测试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)。

实验动物及分组清洁级雄性Lewis大鼠98只，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，常温环境饲养[温度(22±2)℃，湿度40%～70%]，每天照明12 h。动物自由摄食、饮水。采用随机数字表方法将大鼠随机分为7组，每组14只，分别为正常对照(normal control，NC)组，溶剂对照组(PEG 400组和NS组)，CAI低、中、高剂量(10、20、40 mg/kg，灌胃给药)组和阳性药Dex(0.2 mg/kg，腹腔注射)组。大鼠于致炎后12 d即炎症开始出现时给药，连续14 d，每日1次，PEG 400组和NS组给予等容量的相应溶剂。

AA模型制备将卡介苗置于80℃水浴灭活1 h，以高压灭菌的液体石蜡配成10 mg/ml乳剂，充分研磨、混匀，即得弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)。除NC组大鼠，每只大鼠在尾根部2～3点皮内注射0.1 ml FCA致炎。NC组大鼠注射等体积的液体石蜡[6]。

关节炎评分致炎后12、18、22、26 d，采用关节炎评分法观察多发性关节炎的病变程度，具体如下：(1)0分：正常；(2)1分：轻度红肿；(3)2分：中度红肿；(4)3分：严重红肿；(5)4分：肿胀明显并伴有关节强直。每肢最高分数为4分，四肢之和代表每只大鼠的关节炎指数(arthritis index，AI)，最高值为16分[7]。

关节X线检查致炎后27 d，将大鼠麻醉后进行两后肢X线摄片，并分别对骨质疏松、关节间隙狭窄和骨侵蚀3个参数进行放射学评分，具体为：(1)0分：正常；(2)1分：轻度改变；(3)2分：中度改变；(4)3分：严重改变。计算两后肢的分数之和，最高值为6分[6]。

组织病理学检查X线检查后处死大鼠，关节组织取材，10%甲醛固定、5%HNO3脱钙、不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察病理改变并进行评分，具体为：(1)0分：正常；(2)1分：关节组织中有少量炎细胞浸润；(3)2分：滑膜轻度增生，并伴有局灶性炎细胞浸润；(4)3分：滑膜增厚，排列疏松、紊乱，炎细胞大量浸润，新生血管明显增加，伴有少量关节软骨破坏；(5)4分：滑膜增生明显，血管翳形成，关节软骨和骨组织被严重破坏或由纤维结缔组织取代[7]。

足爪组织中细胞因子含量测定大鼠处死后，分离足踝关节周围的皮下组织，制备组织均浆，按照试剂盒说明书采用ELISA方法检测TNF-α、IL- 1β和IL- 6含量。

统计学处理采用SPSS 11.5统计软件，实验数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析后Dunnett’s检验进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

CAI对AA大鼠体重的影响致炎前和致炎后12、18、22、26 d分别测量各鼠体重，以致炎前、后体重的差值表示体重的增加(△g=致炎后体重-致炎前体重)。结果显示，NC组大鼠的体重在实验期间持续增长；与NC组相比，PEG 400组和NS组大鼠于炎症反应期间食欲明显减退，体重明显减轻(P均<0.01)；CAI中剂量组在22和26 d，CAI高剂量组在18、22和26 d可缓解AA大鼠体重的减轻(P<0.05或P<0.01)；Dex对AA大鼠体重的减轻无明显影响(P>0.05)(图1)。

CAI对AA大鼠AI的影响AA大鼠在致炎后12 d四肢关节开始出现炎症症状，AI开始升高，至22 d达高峰(P均<0.01)，表现为四肢关节红肿、变形，并伴有关节强直，大部分AA大鼠还可观察到耳部红斑和尾部串珠样结节突起。CAI低剂量在22、26 d，CAI中、高剂量和Dex在18、22、26 d可明显降低AA大鼠的AI(P均<0.01)，减轻全身关节病变程度(图2)。

CAI：羧胺三唑；AA：佐剂性关节炎；NS：生理盐水；Dex：地塞米松；与NC组比较，aP<0.01；与溶剂对照组比较，bP<0.05，cP<0.01

CAI：carboxyamidotriazole；AA：adjuvant arthritis；NS：normal sodium；Dex：dexamethasone；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

图1CAI对AA大鼠体重增加的影响

Fig1Effect of CAI on the increase in body weight in AA rats

与NC组比较，aP<0.01；与溶剂对照组比较，bP<0.01

aP<0.01 compared with NC group；bP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

图2CAI对AA大鼠关节炎指数的影响

Fig2Effect of CAI on arthritis index in AA rats

CAI对AA大鼠关节放射学改变的影响与NC组相比，AA大鼠出现明显骨质疏松、关节间隙狭窄和骨侵蚀(P均<0.01)，踝及跖趾关节边缘模糊甚至融合，软组织肿胀明显。CAI中、高剂量对骨质疏松、关节间隙狭窄和骨侵蚀均有显著改善作用(P<0.05或P<0.01)；Dex可减轻关节间隙狭窄和骨侵蚀(P<0.05或P<0.01)，但对骨质疏松无影响(图3、表1)。

CAI对AA大鼠关节组织病理学的影响与NC组相比，AA大鼠关节HE染色切片可见大量炎细胞浸润，滑膜组织和纤维组织增生明显，新生血管明显增加，增生的滑膜和血管侵入软骨、骨组织形成特征性血管翳，关节软骨及骨组织被破坏。CAI中、高剂量和Dex可显著改善上述病理损伤(P<0.05或P<0.01)，表现为滑膜组织增生受抑制，炎细胞浸润减少，新生血管生成减少，软骨和骨组织破坏程度减轻(图4、表1)。

CAI对AA大鼠足爪组织中TNF-α、IL- 1β和IL- 6含量的影响与NC组相比，AA大鼠足爪组织中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平显著升高(P均<0.01)。CAI低、中、高剂量和Dex可显著降低TNF-α和IL- 1β水平，CAI中、高剂量和Dex可显著降低IL- 6水平(P<0.05或P<0.01)(图5)。

A.NC组；B.PEG 400组；C.NS组；D.CAI中剂量组；E.CAI高剂量组；F.Dex组

A.NC group；B.PEG 400 group；C.NS group；D.CAI middle-dose group；E.CAI high-dose group；F.Dex group

图3CAI对AA大鼠关节放射学改变的影响

Fig3Effect of CAI on the radiological changes in AA rats

A.NC组；B.PEG 400组；C.NS组；D.CAI中剂量组；E.CAI高剂量组；F.Dex组

A.NC group；B.PEG 400 group；C.NS group；D.CAI middle-dose group；E.CAI high-dose group；F.Dex group

图4CAI对AA大鼠关节组织病理学的影响(HE，×200)

Fig4Effect of CAI on histopathology in AA rats (HE，×200)

表 1　CAI对AA大鼠放射学分数和病理学分数的影响

CAI：羧胺三唑；AA：佐剂性关节炎；NS：生理盐水；Dex：地塞米松；与NC组比较，aP<0.01；与溶剂对照组比较，bP<0.05，cP<0.01

CAI：carboxyamidotriazole；AA：adjuvant arthritis；NS：normal sodium；Dex：dexamethasone；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

TNF：肿瘤坏死因子；IL：白细胞介素；与NC组比较，aP<0.01；与溶剂对照组比较，bP<0.05，cP<0.01

TNF：tumor necrosis factor；IL：interleukin；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

图5CAI对AA大鼠足爪组织中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平的影响

Fig5Effect of CAI on TNF-α，IL- 1β，and IL- 6 levels in the paw tissues of AA rats

讨论

AA模型是一种免疫性炎症模型，其组织病理学改变和实验室指标与人RA相似，因此是筛选和研究治疗RA药物的理想模型[8]。本研究观察到，AA大鼠在致炎后12 d开始出现关节炎症状，22 d病变达高峰，关节红肿、变形，并伴有关节强直。疾病过程中，动物还出现体重下降。大鼠后肢X线检查结果显示，AA大鼠出现明显骨质疏松和骨侵蚀，关节间隙狭窄甚至消失。病理结果显示，AA大鼠关节滑膜增厚，炎细胞浸润，血管翳形成，软骨及骨组织被破坏。为探讨CAI对大鼠AA的治疗作用，于炎症开始出现时(即致炎后12 d)灌胃给药，连续14 d，结果发现，CAI可降低AA大鼠的AI，促进AA大鼠体重的恢复，减轻AA大鼠关节放射学和组织病理学的损伤，表明CAI对大鼠AA有明显改善作用。

细胞因子网络失调与RA发病及病程进展密切相关[9]，在RA关节损伤的病理过程中，TNF-α和IL- 1β是起主导作用的促炎细胞因子，他们相互作用，诱导更多的细胞因子和炎症介质产生；增强内皮细胞黏附分子表达，协助炎症细胞迁徙至关节腔；促进滑膜增生和微血管新生，形成血管翳；减少蛋白聚糖和胶原合成，增加基质降解酶产生，导致软骨基质降解；促进破骨细胞分化和成熟，引起骨质破坏等。临床研究表明，针对TNF-α或IL- 1β的阻断剂，能有效改善RA患者的关节炎症状，阻止病情发展，显示出良好的应用前景[9- 10]。IL- 6也是RA关节炎症中重要的促炎细胞因子，在RA患者的血清和关节滑液中明显升高[11]。本研究结果显示，AA大鼠炎症足爪组织中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平明显升高，CAI可以降低IL- 1β、TNF-α和IL- 6水平。在RA关节部位，高水平的促炎细胞因子来源于大量浸润的炎细胞和增生的滑膜细胞的分泌[12]。组织病理学结果显示，CAI可以减少炎细胞浸润，抑制滑膜增生，这可能是CAI能够减少IL- 1β、TNF-α和IL- 6等促炎细胞因子的原因。另一方面，鉴于促炎细胞因子在RA关节损伤中的重要作用，CAI可能通过降低促炎细胞因子，从而减轻AA大鼠关节炎症以及关节放射学和组织病理学的损伤，发挥对AA大鼠的治疗作用。

目前，临床常用的治疗RA的药物包括糖皮质激素、非甾体类抗炎药和免疫抑制药等，但长期使用这些药物易引起严重不良反应。在本研究中，阳性药Dex能够显著降低AA大鼠的AI，但对AA大鼠体重降低以及放射学检查所表现出的骨质疏松无影响，同时大鼠出现激惹和烦躁等症状。CAI对大鼠AI的抑制作用虽然弱于Dex，但CAI高剂量组在18、22、26 d对AI的降低作用亦很显著，而且，CAI在给药期间可以促进AA大鼠体重的恢复，改善AA大鼠放射学检测中的骨质疏松评分。同时，CAI能够明显降低AA大鼠放射学检测中的关节间隙狭窄和骨侵蚀评分、病理学评分、以及AA大鼠炎症足爪中升高的促炎细胞因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平，且CAI在高剂量时对上述指标的的抑制作用与Dex相当。另外，CAI在用于抗肿瘤的临床试验中，严重不良反应少见，常见的不良反应为轻度的恶心、呕吐等胃肠道反应以及眩晕等中枢神经系统反应[13- 14]。提示CAI有可能成为一种新型的相对安全的治疗RA的药物。

综上，CAI能有效缓解AA大鼠体重的降低，减轻关节炎程度，改善关节放射学和组织病理学损伤，降低炎症足爪中IL- 1β、TNF-α和IL- 6水平。提示CAI对AA大鼠具有明显的治疗作用，其作用机制可能与其降低炎症部位的促炎细胞因子有关，这为CAI发展成为治疗RA的新药提供依据。

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Therapeutic Effect of Carboxyamidotriazole on Adjuvant Arthritis in Rats

ZHU Lei，LI Juan，GUO Lei，YU Xiao-li，WU Dan-wei，CHEN Wei，CHEN Chen，DU Xiao-wan，ZHANG De-chang，YE Cai-ying

Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC, Beijing 100005，China Corresponding author：ZHANG De-changTel：010- 69156401，E-mail：zhangdechang45@vip.sina.com； YE Cai-yingTel：010- 65597159，E-mail：caiyingye@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo study the effect of carboxyamidotriazole (CAI) on adjuvant arthritis (AA) in rats.MethodsThe rats were randomly divided into normal group，two vehicle groups (polyethylene glycol 400 control and normal sodium control group)，CAI-treated groups (10，20，and 40 mg/kg) and positive control dexamethasone group. Freund’s completed adjuvant was used to induce AA in rats. The arthritis index (AI) was scored，and X-ray check of the hind limbs and histopathological examination were performed. The levels of tumor necrosis factor (TNF)-α，interleukin (IL)- 1β，and IL- 6 in the inflamed paw tissues were measured.ResultsThe administration of CAI significantly decreased the AI，restored the body weights，and ameliorated the radiological and histopathological features of joint destruction in AA rats (P<0.05，P<0.01). In addition，CAI reduced the TNF-α，IL- 1β，and IL- 6 levels in the inflamed paw tissues (P<0.05，P<0.01).ConclusionCAI has therapeutic effect on AA rats，which may be achieved by decreasing the pro-inflammatory cytokines at the site of inflammation.

Key words：carboxyamidotriazole；adjuvant arthritis；cytokines

(收稿日期：2015- 03- 25)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.009

中图分类号:R961

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)01- 0049- 06

通信作者：张德昌电话：010- 69156401，电子邮件：zhangdechang45@vip.sina.com；

基金项目：国家自然科学基金(81102454、81201728、81402943)和“重大新药创制”科技重大专项(2014ZX09507003- 003) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81102454，81201728，81402943) and the Special Program for Key Basic Research of the Ministry of Science and Technology of China (2014ZX09507003- 003)