鸸鹋股骨头坏死两种修复方式骨显微结构变化的比较

范　猛，姜文学，汪爱媛，彭　江，张　莉，许文静，卢世璧

1天津市第一中心医院骨科，天津 300192　2中国人民解放军总医院骨科研究所，北京 100853



·论著·

鸸鹋股骨头坏死两种修复方式骨显微结构变化的比较

范猛1，2，姜文学1，汪爱媛2，彭江2，张莉2，许文静2，卢世璧2

1天津市第一中心医院骨科，天津 3001922中国人民解放军总医院骨科研究所，北京 100853

摘要：目的比较鸸鹋股骨头坏死不同造模方式股骨头骨显微结构的差异。方法成年鸸鹋15只，分为3组，每组5只，均以右侧股骨头为研究对象：第1组为正常组，不做处理；第2组为冷冻建立模型组，通过液氮和射频冷热交替的方式建立股骨头坏死塌陷模型；第3组为乙醇建立模型组，通过局部注射无水乙醇的方式建立股骨头坏死塌陷前模型。造模成功后分别取各个实验动物右侧股骨标本，股骨标本近端行显微计算机断层摄影扫描，并进行3组标本骨显微结构参数的比较和统计分析。结果所有鸸鹋术后无明显感染征象，未发生实验动物异常死亡。与正常组相比，冷冻建立模型组骨小梁改建后骨矿物量(P=0.015)和骨小梁间距(P=0.001)明显减少，骨体积比(P=0.036)、骨表面积/体积比(P=0.032)和骨小梁数目明显增加(P=0.002)，骨小梁厚度差异无统计学意义(P=0.060)。与正常组相比，乙醇建立模型组骨小梁改建后骨矿物量明显增高(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.003)和骨表面积/体积比(P=0.022)明显增加，骨小梁间距(P=0.001)和骨体积比(P=0.001)明显减少，骨小梁数目差异无统计学意义(P=0.143)。与乙醇建立模型组比较，冷冻建立模型组的骨矿物量(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.001)和骨体积比(P=0.001)明显减低，骨表面积/体积比(P=0.022)和骨小梁数目(P=0.003)明显增高，骨小梁间距差异无统计学意义(P=0.398)。结论不同修复方式可造成重建后股骨头负重区骨小梁结构及骨密度的不同，产生的重建骨小梁骨质量也不同。

关键词：股骨头缺血性坏死；动物模型；骨小梁；鸸鹋；显微结构

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：16-21

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是骨科常见的一种难治性疾病，好发于中青年，自然进展快，致残率高[1]。本课题组前期研究通过液氮冷冻及局部注射无水乙醇的方式分别建立了鸸鹋的ONFH动物模型，发现鸸鹋在不同建模方法中体现了明显不同的病理状态，表现为不同的修复方式和截然不同的塌陷率[2- 3]。已有研究证实，不同修复方式会造成ONFH后的不同结局，并建议通过了解患者的修复方式采取个体化治疗[4- 5]。但ONFH的标本获取较为困难[5]，如果通过无创影像学检查可以确认骨坏死的修复方式，则无疑有利于ONFH的个体化治疗。本研究比较了鸸鹋股骨头坏死不同造模方式股骨头骨显微结构的差异，试图发现不同修复方式的不同骨显微结构改建特点，以期更好地进行ONFH机制及治疗个体化研究。

材料和方法

实验动物及分组健康成年雄性鸸鹋15只，月龄>12个月，体重(50.0±4.6)kg，由中国人民解放军总医院动物实验中心提供。分为3组，每组5只，均以右侧股骨头为研究对象：第1组为正常组，不做处理；第2组为冷冻建立模型组，通过液氮和射频冷热交替的方式建立ONFH塌陷模型[3]；第3组为乙醇建立模型组，通过局部注射无水乙醇的方式建立ONFH塌陷前模型[2]。

影像学检查造模成功后分别取各个实验动物右侧股骨标本，股骨标本近端行显微计算机断层摄影(micro-computed tomography，Micro-CT)(explore Locus，美国GE公司)扫描，扫描分辨率为46 μm，单次扫描时间18 min。于中国人民解放军总医院骨组织库采取1枚成人股骨头坏死塌陷标本和1枚成人健康股骨头标本扫描进行图像对照。

计算方法以Micro-CT机器附带的GE Microview软件进行图像后处理。在各组股骨头软骨下区域负重区选取4 mm×4 mm×4 mm范围股骨头作为研究兴趣区，分别计算骨矿物量，骨小梁厚度、间距、数目，骨体积比，骨表面积/体积比。通过Miroview软件功能获取兴趣区内不同厚度骨小梁分布比例数据。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，3组间及组内数据差异比较采用单因素ANOVA分析，此后各组的两两比较采用LSD检验，数据方差齐性分析采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一般情况所有鸸鹋术后无明显感染征象，未发生实验动物异常死亡。与健康成人股骨头比较，成年鸸鹋股骨头的骨小梁明显稀疏，但排列方式与人类类似，均表现为骨小梁方向多垂直于关节面，小梁宽度及间隙较为均匀，靠近关节面小梁较为细密(图1)。

各组间骨显微结构参数的比较与正常组相比，冷冻建立模型组骨小梁改建后骨矿物量(P=0.015)和骨小梁间距(P=0.001)明显减少，骨体积比(P=0.036)、骨表面积/体积比(P=0.032)和骨小梁数目明显增加(P=0.002)，骨小梁厚度差异无统计学意义(P=0.060)(图2、表1)。在人类塌陷股骨头中也可见类似改变(图3)。

Micro-CT：显微计算机断层摄影

Micro-CT：micro-computed tomography

A.正常成人股骨头结构，小梁紧密，排列规则；B. 正常鸸鹋Micro-CT冠状面图，与人类相比，股骨头内小梁明显稀疏，但排列方式与人类类似，骨小梁方向多垂直于关节面，间距及宽度较为均匀

A.normal femoral head bone structure of adult human，in which the trabecula ranged regularly and tightly；B.normal femoral head bone structure of adult emu，in which the trabecula ranged regularly as human’s，though much loosely；the trabecula is often vertical to the articular surface，with relatively even spacing and width

图1正常人与正常鸸鹋股骨头结构的比较

Fig1Comparision of normal femoral head structure between human and emu

与正常组相比，乙醇建立模型组骨小梁改建后骨矿物量明显增高(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.003)和骨表面积/体积比(P=0.022)明显增加，骨小梁间距(P=0.001)和骨体积比(P=0.001)明显减少，骨小梁数目差异无统计学意义(P=0.143)(图4、表1)。

与乙醇建立模型组相比，冷冻建立模型组的骨矿物量(P=0.001)、骨小梁厚度(P=0.001)和骨体积比(P=0.001)明显减低，骨表面积/体积比(P=0.022)和骨小梁数目(P=0.003)明显增高，骨小梁间距差异无统计学意义(P=0.398)(表1)。

A. 2号鸸鹋16周(已明显塌陷)；B. 3号鸸鹋16周图像(已轻度塌陷)

A. emu 2# at week 16 (obvious collapse)；B. emu 3# at week 16 (mild collapse)

图2冷冻建立模型组鸸鹋股骨头Micro-CT冠状位图像，可见负重区关节面塌陷，塌陷区域骨小梁改建明显，软骨下骨表现为细小密集的骨小梁，更接近正常区的交界骨小梁表现为小梁宽度增粗

Fig2Coronal Micro-CT images of emu femoral head in cryogen group，showing collapse at weight-bearing area；the corresponding subcondral trabecula became samller and arraged more tightly，and the trabecula at connected transtitional area became thicker

表 1　3组骨显微结构参数的比较(n=5，x-±s)

BMD：骨矿物量；TbTh：骨小梁厚度；TbSp：骨小梁间距；BVF：骨体积比；BS/BV：骨表面积/体积比；TbN：骨小梁数目；与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01；与冷冻建立模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

BMD：bone mineral density；TbTh：trabecular thickness；TbSp：trabecular space；BVF：bone volume fraction；BS/BV：bone surface/volume fraction；TbN：trabecular numbers；aP<0.05，bP<0.01 compared with normal group；cP<0.05，dP<0.01 compared with cryogen group

各组间不同厚度骨小梁分布情况比较结果显示，与正常组相比，冷冻建立模型组骨小梁宽度较小的骨小梁所占比率较高，而乙醇建立模型组则厚度较大的骨小梁所占比率较高(图5)。与正常组相比，冷冻建立模型组负重区骨小梁改建后小梁厚度分布波峰左移，乙醇建立模型组骨小梁厚度分布波峰右移(图6)。

A.鸸鹋；B.成人

A.emu；B.human

图3鸸鹋与人类塌陷股骨头标本可见类似改变：负重区关节面塌陷，塌陷区域骨小梁改建明显，部分软骨下骨表现为细小密集的骨小梁，头内接近正常区骨质的交界区骨小梁表现为小梁宽度增粗

Fig3The collapsed femoral heads of emu and human show simialr changes：collapse occured at weight-bearing area,the trabecula at corresponding area remarkably changed,the subcondral trabecula became samller and arraged more tightly,and the trabecula at connected transtitional area became thicker

A.1号鸸鹋6月图像(负重区骨小梁大部改建)；B.2号鸸鹋6月图像(负重区骨小梁基本完全改建)

A.emu 1# at month 6 (most trabecula in weight-bearing area has been repaired)；B.emu 2# at month 6 (nearly all trabecula in weight-bearing area has been repaired)

图4乙醇建立模型组鸸鹋股骨头Micro-CT冠状位图像，可见大片骨质出现小梁增粗，但骨小梁排列仍整齐

Fig4Coronal Micro-CT images of emu femoral head in ethanol group，showing a lot of trabecula becoming thicker but still arranged regularly

与正常组比较，aP<0.05；与冷冻建立模型组比较，bP<0.05

aP<0.05 compared with normal group；bP<0.05 compared with cryogen group

图5各组鸸鹋股骨头负重区不同宽度骨小梁厚度分布比率比较

Fig5Comparison of the trabecular thickness ratio at weight-bearing area among all groups

图6骨小梁厚度分布曲线

Fig6Distribution curve of trabecular thickness ratio

讨论

ONFH后修复方式不同可造成ONFH不同进程和结局的理论由来已久[6]。破坏性修复被认为是造成股骨头软骨下骨骨折塌陷的主要原因，最终通常会因股骨头塌陷而需进行髋关节置换手术治疗[7- 8]。虽然有多种的保头治疗措施可以改善ONFH的临床症状，或者采用干细胞等方式来改善股骨头的修复，但对于破坏性修复的ONFH而言，其结果往往仍然是股骨头的塌陷[4，8]，而非破坏性修复的修复方式则通常不会出现股骨头塌陷[7，9- 12]，应根据ONFH的修复方式选择个体化治疗措施[5]。

本课题组以往通过局部注射的方法成功建立了鸸鹋的ONFH模型[2]，实验动物均有不同程度的骨坏死表现，伴有骨修复反应，已经通过对模型的组织学评价证实其修复方式为重建性修复[2，13- 14]。本课题组还采用冷热交替的方法建立了鸸鹋的股骨头缺血性坏死塌陷模型[3]，实验动物表现为较高的塌陷率，在前期模型组织学评价中发现修复方式表现为破坏性修复[3- 4]。本研究比较了不同骨坏死修复方式下的骨显微结构，结果发现在不同修复方式下骨改建的形式也具有明显差异，两者之间的骨显微结构也存在明显差异。破坏性修复形成的小梁较细小密集，骨密度低，骨小梁的显微结构中以较小厚度的为主，从而易于塌陷；重建性修复修复改建后的骨质小梁较粗，且密集，而且保持着原有的排列，骨小梁显微结构中以较高厚度的为主，具有较好的力学性能。

国内外研究显示，在破坏性修复，修复快速，病程短，成骨明显滞后于破骨，纤维组织填充，形成囊性变，影响股骨头力学强度；而在重建性修复，则可能表现为成骨与破骨的相对同步，实现死骨的爬行替代，对股骨头的力学强度影响较小[4- 5]。本研究结果显示，破坏性修复所造成的股骨头力学强度减低，不仅仅局限于成骨滞后于破骨纤维填充出现囊性变，而且其成骨后形成的新的小梁结构相对于健康骨小梁的强度也不足，可能是引发股骨头的塌陷力学原因。本研究还发现有的鸸鹋并没有出现明显的囊性变，也出现了塌陷，这也很好的验证了这一点。而引发这种小梁形式的差异，笔者考虑与快速破骨后成骨过程无原有框架，且在破坏性修复过程中血供丰富，新骨间广泛分布髓腔多个成骨中心有关。

本研究中，冷冻建立模型组与正常股骨头在负重区骨小梁厚度平均值并没有显著差异，但通过对不同厚度骨小梁分布情况研究发现，冷冻建立模型组骨小梁厚度分布峰值明显左移，显示其改建后小梁厚度出现了减小。虽然冷冻造模组骨小梁分布曲线未表现出波峰顶点位置，但已明显左移，推测未出现顶点确切位置与本研究中所采用的Micro-CT扫描精度有关，本研究采用了45 μm精度进行扫描，不能分析更细的小梁结构。本课题组将在后期研究中采用更高的精度进行分析，以进一步明确冷冻后改建小梁的厚度分布。

通过统计学的对照分析，本研究证实两种不同修复方式下存在着骨小梁显微参数的明显区别，同时均与正常的股骨头结构存在明显差别，由此进一步验证了不同修复方式会影响骨坏死不同的修复进程和骨坏死最终的结局。后期治疗中，有望通过改变修复方式，进而改变骨重建方式而改变骨的显微结构，改善其力学性能而预防股骨头塌陷。反之，也可能通过对于股骨头进行高精度CT检查，观察骨小梁改建形态，来早期推断ONFH的修复类型，在早期就进行针对性治疗，包括影响ONFH的修复方式来保存股骨头[15- 16]。

本研究存在以下不足：(1)样本量较小。(2)测量过程中Micro-CT测量精度的选择可影响结果的准确性。(3)未进行股骨头造模后的力学测试，仅从骨小梁结构与骨密度改变及不同病程推测股骨头力学状态改变。在后期的研究中，本课题组将结合生物力学测试进一步进行验证。

综上，本研究结果显示，不同修复方式可造成重建后股骨头负重区不同的骨小梁结构及骨密度，产生股骨头坏死病程中不同的骨质量，从而影响股骨头坏死的结局。破坏性修复形成的小梁较细小密集，骨密度低，易于塌陷；重建性修复则修复改建后骨质小梁较粗，且密集，而且保持着原有的排列，具有较好的力学性能。本研究有利于加深对于ONFH塌陷机制的认识，指导治疗措施。而且可能通过对股骨头骨小梁结构改变方式的研究从而以无创的方式确定其修复方式，进而实现ONFH的个体化治疗。

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Comparisons of Emu Necrotic Femoral Head Micro Structure Repaired in Two Different Methods

FAN Meng1，2，JIANG Wen-xue1，WANG Ai-yuan2，PENG Jiang2，ZHANG Li2，XU Wen-jing2，LU Shi-bi2

1Department of Orthopeadics，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China2Institute of Orthopeadics，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China Corresponding author：PENG JiangTel：010- 66939202，E-mail：pengjiang301@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo compare emu necrotic femoral head micro structure repaired in two different methods.MethodsFifteen adult emus were divided into 3 groups(all n=5)，and the right femoral head was selected to research. The first group was the control group；in the second group，femoral head necrosis was made by cryogen with liquid nitrogen；and in the third group，femoral head necrosis was made by local pure ethanol injection. Right femurs were taken for micro CT examination，then femoral head micro structures were compared among these three groups. ResultsNo infection or unexpected death was found in all groups. Compared with normal group，necrotic femoral heads in cryogen group showed that bone mineral density significantly reduced after repaire (P=0.015)，trabecular space significantly reduced (P=0.001)，bone volume fraction significantly enlarged (P=0.036)，bone surface/volume fraction (P=0.032) and trabecular numbers (P=0.002)significantly enlarged；trabecular thickness showed no significant difference (P=0.060). Compared with control group，necrotic femoral heads in ethanol group showed that bone mineral density significantly enlarged after repaire (P=0.001)，trabecular thickness (P=0.003) and bone surface/volume fraction (P=0.022) significantly enlarged，trabecular space (P=0.001) and bone volume fraction (P=0.001) significantly reduced；the trabecular numbers showed no significant difference (P=0.143). Compared with ethanol group，necrotic femoral heads in cryogen group showed significant lower bone mineral density after repair (P=0.001)，significantly lower bone volume fraction (P=0.001)，significantly lower trabecular thickness (P=0.001)，significantly higher bone surface/volume fraction (P=0.022) and higher trabecular numbers (P=0.003)；the trabecular space showed no significant difference (P=0.398). ConclusionDifferent repair methods make reconstructed femoral head weight bearing area have different bone structure and bone mineral density，along with different bone trabecular quality.

Key words：femoral head necrosis；animal model；trabecula；emu；micro structure

(收稿日期：2015- 04- 17)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.003

中图分类号:R68

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)01- 0016- 06

通信作者：彭江电话：010- 66939202，电子邮件：pengjiang301@126.com

基金项目：国家自然科学基金重点项目(30930092)和天津市卫生局科技基金(2012KY09)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30930092)and the Tianjin Health Bureau Technology Fund(2012KY09)