高效液相色谱法同时测定土贝母中土贝母苷甲、乙和丙的含量*

黄 瑾，张 杰，顾正兵

（1．上海市浦东新区人民医院药剂科，上海 201299； 2．江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州 225300）

高效液相色谱法同时测定土贝母中土贝母苷甲、乙和丙的含量*

黄 瑾1，张 杰2，顾正兵2

（1．上海市浦东新区人民医院药剂科，上海 201299； 2．江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州 225300）

目的 建立同时测定土贝母中土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙3种皂苷类成分含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法 色谱柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流动相为乙腈－水(31∶69)，流速为1．0 mL／min，柱温为30℃，检测波长为214 nm。结果 土贝母苷甲、乙、丙进样量分别在1．28～12．8 μg，0．241～2．41 μg，0．515～5．15 μg范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率分别为99．10%，98．95%和98．78%，RSD分别为0．43%，0．62%，0．46%(n＝6)。结论 该法简便、准确，可为土贝母的质量评价提供参考。

土贝母；高效液相色谱法；土贝母苷甲；土贝母苷乙；土贝母苷丙

土贝母为葫芦科植物土贝母 Bolbostemma panicula- tum(Maxim．)Franquet的干燥块茎，具有解毒、散结、消肿的功效，主治乳痈、瘰疬、痰核[1]。土贝母中的皂苷类成分具有显著的抗肿瘤及抗促瘤活性，其皂苷类代表性成分为土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙，且土贝母苷乙和丙抗肿瘤活性强于土贝母苷甲，毒性均低于苷甲[2－10]。2010年版《中国药典(一部)》仅以土贝母苷甲为指标性成分，不能全面控制此药材的质量。目前，国内外关于土贝母含量测定的文献报道较少，且均为单一测定了土贝母苷甲的含量[11－13]。本试验中建立了同时测定土贝母中土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙含量的高效液相色谱(HPLC)法，可为土贝母药材的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Waters－1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Sartorius CP225D十万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ 2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。对照品土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙均从土贝母中经制备液相分离纯化得到，经过MS，1H－NMR，13C－MNR鉴定化合物结构，通过HPLC测定，用面积归一化法计算纯度均大于 98%。乙腈（色谱纯，上海蓝世生化技术有限公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。土贝母药材来源于全国各地，经嘉兴学院医学院王峻副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2．1 溶液制备

取不同来源的样品粉末（过4号筛）约1．0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称重，用70%乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0．45 μm）滤过，即得供试品溶液。精密称取对照品土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙适量，分别用甲醇制成土贝母苷甲、乙、丙质量浓度为1．941，0．604 1，0．736 3 g／L的单一对照品贮备液。精密量取上述3个对照品贮备液适量，用甲醇稀释，制成每1 mL分别含土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙0．640 2，0．120 8，0．257 6 mg的混合对照品溶液。

2．2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（31∶69）；流速：1．0 mL／min；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测波长：214 nm。在此条件下，对照品及供试品溶液色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2．3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色谱仪，测定。以峰面积值（Y）对进样量（X）作线性回归，得土贝母苷甲的回归方程为 Y＝118 640X－56 002（R2＝0．999 3），线性范围为1．28～12．8μg；土贝母苷乙的回归方程为 Y＝105700X－12 908（R2＝0．999 5），线性范围为0．241～2．41 μg；土贝母苷丙的回归方程为 Y＝92 380 X－20 936（R2＝0．998 7），线性范围为0．515～5．15 μg。

精密度试验：取同一混合对照品溶液，连续进样6次。结果土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙峰面积的RSD分别为0．73%，1．2%，1．0%(n＝6)，表明仪器的精密度良好。

重复性试验：取同一批土贝母药材 6份，按 2．1项下方法制备供试品溶液，进样分析。土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙含量的测定，结果的 RSD分别为 1．1%，1．7%，1．4%(n＝6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h时进行HPLC测定，每次进样10 μL，记录峰面积。结果土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙峰面积的 RSD分别为1．2%，2．3%，1．6%(n＝5)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的样品6份，每份约0．5 g，精密称定，分别准确加入一定量的对照品贮备液，按2．1项下方法制备供试品溶液，进样测定含量，计算回收率，结果见表1。

表1 3种皂苷类成分加样回收试验结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取不同来源的干燥土贝母粉末约1．0 g，精密称定。按2．1项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算不同来源的土贝母药材中土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙含量。结果见表2。

表2 不同来源土贝母药材中各成分含量测定结果(mg／g，n＝3)

3 讨论

本试验中比较了甲醇－水、乙腈－水两个流动相系统，由于土贝母苷乙和土贝母苷丙结构相近，极性差异小，甲醇－水系统不能使3个成分很好地分离，其次甲醇在确定的检测波长（214 nm）下末端吸收较大，从而确定选择乙腈－水系统。曾比较过等度洗脱以及梯度洗脱，发现以乙腈－水（31∶69）为流动相等度洗脱，各成分均能达到基线分离，且分析时间较短。此外，利用DAD检测器对200～400 nm波长范围内的色谱峰进行对比，综合考虑基线、色谱峰峰形及响应值、干扰成分，最终确定检测波长为214 nm。

样品提取时，以土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙为评价指标，考察了超声、回流2种提取方式及甲醇、乙醇2种提取溶剂，综合考虑，确定用乙醇超声提取。用单因素考察乙醇浓度、提取体积和提取时间，确定最佳工艺为70%乙醇、25 mL、超声提取0．5 h。此供试品溶液制备方法，与2010版《中国药典》相应的方法比较，用70%乙醇经超声提取，过滤后直接进样分析，操作简便、经济环保且分离效果好。

由表2可知，土贝母药材中土贝母苷甲含量＞土贝母苷丙含量＞土贝母苷乙含量，4个不同来源的土贝母药材中各成分含量差异较小，其中山西产土贝母含量相对略高。本试验中首次建立了用HPLC法同时测定土贝母药材中土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙含量的方法，操作简单可行、结果准确，为土贝母的质量控制提供参考依据。

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Determination of TubeimosideⅠ,TubeimosideⅡand TubeimosideⅢ in Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet by HPLC

Huang Jin1,Zhang Jie2,Gu Zhengbing2

(1．Department of Pharmacy,Shanghai Pudong New Area People′s Hospital,Shanghai,China 201299; 2．Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology CO．,LTD．,Taizhou,Jiangsu,China 225300)

Objective To develop an HPLC method for content determination of tubeimosideⅠ,t－ubeimosideⅡand tubeimosideⅢ in Bolbostemmapaniculatum(Maxim．)Franquet．Methods The determination was carried out on a C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm) eluted with acetonitrile and water．The flow rate was 1．0 mL／min,and the detected wavelength was set 214 nm．Results The peak areas and the sample quantity of the three components had good linear relationship in the range of 1．28～12．8 μg for tubeimosideⅠ, 0．241～2．41 μg for tubeimosideⅡ and 0．515～5．15 μg for tubeimosideⅢ．The average recoveries were 99．10%,98．95% and 98．87%,respectively．Conclusion The method was proved to be simple,accurate and provided reference for comprehensive quality control of Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet．

Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet;HPLC;tubeimosideⅠ;tubeimosideⅡ;tubeimosideⅢ

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)01－0058－03

黄瑾，博士研究生，主要从事药品检验工作，(电话)021－58921995(电子信箱)john70550＠163．com；顾正兵，博士研究生，主要从事药品检验工作，本文通讯作者，(电话)0523－80183620(电子信箱) zbg＠youging．com。

2015－07－28；

2015－09－22)

*上海市浦东新区卫生局面上项目，项目编号：PW2013A－12。