一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

沈美艳　孙秋艳　王传春　（山东畜牧兽医职业学院　山东 潍坊　261061）韩凤福　（山东省高唐县畜牧水产局）



一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

沈美艳孙秋艳王传春（山东畜牧兽医职业学院山东 潍坊261061）
韩凤福（山东省高唐县畜牧水产局）

摘要从蓝耳病疑似患猪病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验采用细胞培养、RT-PCR、免疫荧光技术等进行病毒的分离和鉴定。结果表明：Marc145细胞接种出现典型的细胞病变，毒价为5.5×105 TCID50/mL, RT-PCR扩增出特异性长度为559bp的DNA片段，用PRRSV N 蛋白单克隆抗体为一抗，羊抗小鼠IgG-FITC为二抗进行免疫荧光检测，检测到接种病毒的Marc145细胞中特异性荧光信号。说明该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒。

关键词猪繁殖与呼吸综合征免疫荧光检测RT-PCR

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiretory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种接触性传染病。以母猪发热、厌食、怀孕后期发生流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等为主要临床特征，仔猪表现为呼吸道症状和高死亡率。1987年在美国首先发现该病，我国于1996年首次分离到该病毒。2006年以来，该病毒的变异株在我国出现，引起高致病性蓝耳病，给养猪业造成严重的损失。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。有囊膜，单股正链RNA。PRRSV有欧洲型和美洲型两个基因型，二者的基因组和抗原性差异很大，但引起相似的症状。我国分离株为美洲株，其中引起高致病性蓝耳病的的毒株为基因变异株。本研究对疑似蓝耳病的病料进行病毒的分离，经RT-PCR、病毒培养特征免疫荧光技术等检测，证实为猪繁殖与呼吸综合征病毒。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本2011年学院动物医院病例。患猪体重30-50Kg,厌食，精神沉郁，体温高、眼睛流泪，眼脸水肿、咳嗽、气喘，有的猪只腹部皮肤发红，耳朵发绀。剖检淋巴结肿大，棕褐色，肺脏红褐色花斑状。

1.1.2试剂及仪器Marc145细胞由山东农业大学赠送，本实验室保存；PRRSV N蛋白单克隆抗体由山东省农业科学院畜牧所猪病室赠送；羊抗小鼠IgG-FITC、胰蛋白酶、DMSO为Invitrogen产品；新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司，RT-PCR试剂盒购自青岛立德生物有限公司，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾等为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1病料采集和处理剖检疑似PRRS病例，无菌采集病猪的气管和肺脏组织。病料剪碎，按1:5加入灭菌生理盐水，匀浆，冻融3次，4℃10000r/min离心20min，收取上清液，过滤除菌，作为RT-PCR检测和病毒分离培养用样品。

1.2.2电泳、观察反转录PRC(RT-PCR)提取核酸，42℃反转录40min (RT buffer Mix 14.5Ul,M-MLV 1μl，Primer 1.5μl，模板核酸3μl)，为cDNA；然后进行PCR扩增(PCR buffer Mix 26.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板2μl，primer 1μl)94℃预变性5min；变性20s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环，72℃终延伸5min。取PCR产物8ul在2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪观察结果。

1.2.3病毒的分离鉴定在6孔细胞板上用含10%新生牛血清的EMEM将Marc145细胞培养至单层，将细胞培养液置换成维持液，RT-PCR检测阳性的样品过滤除菌后0.1ml接种于Marc145细胞单层，于37℃、5%CO2条件下培养，观察CPE。出现PRRSV典型CPE(细胞变圆、皱缩、聚堆、折光性增强)的样品，以RT-PCR验证。将第6代细胞分离毒在96孔细胞培养板上进行病毒滴度测定，根据Reed—Munch法计算分离毒TCID50。

1.2.4免疫荧光检测(IFA)（1）将Marc145细胞在12孔板上进行爬片培养，形成细胞单层后换成维持液，并接种0.1MOI PRRSV，病毒接种后30h，吸弃细胞培养液，用PBS小心冲洗3次，加入甲醇/丙酮液固定。将爬片取出,进行免疫荧光检测。（2）方法：加PRRSV N蛋白单克隆抗体，37℃作用1～2h，PBS洗涤5次；滴加羊抗小鼠IgGFITC，37℃避光作用1～2h，PBS洗涤5次；用OLYMPUS倒置荧光显微镜观察。

2　结果

（1）病料处理后的样品，经RT-PCR扩增，紫外检测，观察到目的条带，见图1。（2）对PCR阳性的病料用Marc145细胞进行培养，培养至第二代出现典型CPE，见图2。并以RT-PCR进行重复验证。（3）以PRRS N蛋白单克隆抗体为一抗，以羊抗小鼠IgG-FITC为二抗进行染色，在荧光显微镜下，样品接种组观察到细胞中明显的荧光，对照组没有观察到荧光。见图3。

图1　疑似PRRS病料PCR检测结果

图2　Marc145细胞CPE

图3　免疫荧光检测(PRRSV N-蛋白单抗为一抗, 羊抗小鼠IgG-FITC为二抗)

3　小结与讨论

病料RT-PCR检测结果、Marc145细胞上形成的CPE、免疫荧光检测结果证实所分离的病毒为PRRSV，命名为SD16株。猪繁殖与呼吸综合征在猪场广泛存在，猪只发病导致直接经济损失巨大，而免疫抑制和持续感染状态的存在也给免疫和净化带来很大困难。在综合防控方案中，对于疑似病例的及时准确的诊断十分重要。PCR检测是目前较快速的诊断方法之一，在对临床病例的诊断中，结合临诊症状、病例变化可做成较为准确的判断。但因PCR操作环境可能受气溶胶污染等因素的影响，也需考虑PCR 结果的特异性问题。因此，在临床诊断的基础上，PCR检测、细胞培养和IFA检测相结合，可从病毒生长、免疫、基因等不同特征对分离的病毒进行鉴定，为猪场PRRS的长期防控方案提供更准确有力的数据支持。

参考文献

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[5] 任慧英, 杨汉春, 高云等. 用反转录2聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究[J]. 中国兽医科技, 1999, 19(2): 3-5.

畜牧生产

收稿日期：（2016–01–04）

基金项目：科技部国家级星火计划，项目编号：2011GA740034

中图分类号：S858.28

文献标识码：A

文章编号：1007-1733(2016)01-0005-02