复方曲肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

李若林，李衍芳，刘 芳，杨 文，逯冉冉，钟珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚晓昆



复方曲肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

李若林，李衍芳，刘 芳，杨 文，逯冉冉，钟珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚晓昆

[摘要]目的 研究复方曲肽对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将雄性SD大鼠随机分为正常对照(normal control，NC)组、大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCAO/R)组及MCAO/R+复方曲肽[MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)]组3组(每组10只)。缺血1 h再灌注23 h后，各组取6只动物接受神经功能评分后进行MRI检查，随后处死行2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色检测脑梗死体积；各组另4只动物处死，免疫蛋白印迹检测缺血半暗带中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8的表达。结果 MCAO/R组术后动物均出现了脑梗死病灶及神经功能的损伤，复方曲肽治疗可减小脑梗死体积并改善神经功能。MCAO/R组缺血半暗带中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表达显著高于NC组(P＜0.05)，MCAO/R+TC组Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表达低于MCAO/R组(P＜0.05)。结论 复方曲肽对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机制与复方曲肽抑制细胞凋亡相关基因表达从而达到抗凋亡作用有关。

[关键词]脑缺血；复方曲肽；细胞凋亡；2，3，5-三苯基氯化四氮唑

[作者单位]261053山东潍坊，潍坊医学院(李若林，李衍芳，刘 芳，杨 文，逯冉冉，钟珊珊，朱 喆，王小倩)；100048北京，海军总医院神经内科(俞英欣，任 明，戚晓昆)

急性缺血性卒中是临床上常见病、多发病。其患病率、病死率、致残率非常高，严重影响患者的生活质量[1]。尽管对其损伤机制的研究很多，但缺血再灌注性脑损伤的机制仍有争议。研究表明，细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤关系密切，是在基因调控下通过多种复杂途径介导完成的[2]，且在脑梗死的发生、发展过程中发挥重要作用[3]。复方曲肽注射液是由曲克芦丁、活性多肽、多种氨基酸及神经节苷脂组成的复方制剂。曲克芦丁具有抑制红细胞和凝血因子聚集的作用，防止血栓形成，同时能增加血中氧的含量，改善微循环[4]；多肽和氨基酸物质能够促进脑内蛋白的合成，改善神经元物质代谢，起到营养和保护神经的作用[5-6]。但其脑保护作用是否与其抑制脑缺血后的神经细胞凋亡有关鲜见报道。

本实验在构建大鼠大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebralarteryocclusion reperfusion，MCAO/R)模型的基础上，采用神经行为学评分、MRI、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色、免疫印迹方法，观察复方曲肽对MCAO/R大鼠神经行为学、脑梗死体积、凋亡因子表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠30只[青岛大任富城畜牧公司，SCXK-(鲁)-2014-0007]，体质量220～250 g，置于室温(25±2)℃分笼饲养，均自由进食、饮水，光照∶黑暗/12 h∶12 h。

1.1.2主要试剂 TTC；兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8(BBI生命科学有限公司)；辣根过氧化物酶-羊抗兔二抗(武汉博士德生物有限公司)；复方曲肽注射液(吉林步长制药有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组 动物随机分为正常对照(normal control，NC)组、MCAO/R组和MCAO/R+复方曲肽(troxerutinand cerebroprptein，TC)组3组(每组10只)。10倍生理盐水稀释复方曲肽注射液，模型动物按2 mL/100 g腹腔注射稀释复方曲肽注射液，大脑中动脉闭塞后同时给药。各组取6只动物行MRI、TTC染色测量脑梗死体积，各组另4只检测Caspase 1、Caspase 3及Caspase 8表达。

1.2.2MCAO模型制备 10%水合氯醛(0.4 mL/ 100 g)麻醉大鼠，腹面向上，颈部备皮并消毒。取颈正中切口，钝性分离右侧颈总动脉及颈内外动脉，结扎颈外动脉，动脉夹夹闭颈总动脉，于颈总动脉游离端剪一小口，并在小口下系一松结。将制备好的线栓经该切口顺颈总动脉插入，使之与颈内动脉走行平行。将线栓顺颈内动脉走向，轻柔缓慢推进，感到有轻度阻力为止，进线深度1.8～2.0 cm，系紧预先打好的松结，术中保持体温37℃，1 h后拔出线栓，恢复灌注23 h后进行其他评估，术后单独饲养。

1.2.3神经功能学评分 缺血1 h再灌注23 h后采用盲法进行神经功能评分。依据Garcia JH评分，从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、网屏实验、身体双侧触觉、双侧胡须反射6个方面评定大鼠神经功能损伤程度，功能正常时得分最高(18 分)，功能损伤最严重得分最低(3分，表1)。

1.2.4MRI 神经功能检查结束后，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，将大鼠头部固定在木板上，取仰卧位，行MRI获得缺血1 h再灌注23 h后大鼠T2加权像、T2液体衰减反转恢复序列(fluid attenuated inversion recovery，FLAIR)和表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)。图像处理软件计算梗死区与对侧大脑组织的信号强度比值，分析各组间的参数变化，P＜0.05为有统计学意义。

1.2.5脑梗死体积 MRI后，大鼠直接断头取脑，TTC染色。从距额极3 mm处开始，从前往后作冠状位连续切片，每片厚度2 mm，共6片。将大脑切片浸泡于2%的TTC溶液中，37℃恒温避光10min，正常脑组织染为玫瑰红色，脑梗死区不染色(白色)。将脑片浸泡于4%多聚甲醛磷酸缓冲液内，固定30 min后，脑片按脑的前后顺序整齐排列，拍照保存后输入计算机。用图像处理软件计算脑梗死体积，6张脑片梗死体积之和视为脑梗死体积。

表1　Garcia JH大鼠神经功能评分标准

1.2.6Western印迹法 各组大鼠随机取4只，10%水合氯醛深度麻醉后，断头处死，快速取出完整大脑，将缺血半暗带脑组织取出，正常对照组取缺血区对应部位脑组织，分别称重后提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白浓度，制备10%分离胶和5%浓缩胶，根据蛋白浓度确定上样体积并电泳。把凝胶上蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上并将其置于5%脱脂奶粉封闭液中，室温下封闭1 h后再加入一抗(Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8)孵育，4℃过夜，洗膜后加入二抗(山羊抗兔抗体)于室温下反应2 h，洗膜后滴加电化学发光液，X线片显影，IPP 7.0和图像分析软件进行灰度分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为对照。

1.3统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1脑梗死体积 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/ R组脑梗死体积显著高于MCAO/R+TC组(P＜0.05，图1、图2)。

图1　TTC染色脑梗死体积缩小的抽象图

图2　脑梗死体积变化

2.2MRI 缺血1 h再灌注23 h后MRI显示，MCAO/ R组可见左脑出现高信号强度区，与周围组织对比明显；MCAO/R+TC组T2加权像、T2FLAIR信号强度比值降低(P＜0.05)，且ADC值升高。见图3、图4。

图3　T2加权像、T2FLAIR、ADC的MRI

2.3神经功能评分 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/R组神经功能评分低于NC组(P＜0.05)，而MCAO/R+TC组神经功能评分则高于MCAO/R组(P＜0.05)，见图5。

2.4Western印迹法 分析缺血1 h再灌注23 h后缺血半暗带中含Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表达，结果显示MCAO/R组缺血半暗带中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8的表达高于NC组(P＜0.05)，而MCAO/R+TC组缺血半暗带中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表达低于MCAO/R组(P＜0.05，图6、图7)。

图6　大鼠脑梗死部位组织Western印迹法分析

图7　缺血半暗带Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表达的半定量分析

3　讨论

本研究采用SD大鼠脑缺血再灌注模型，通过神经功能评分、MRI技术、TTC染色手段，发现复方曲肽能减少脑梗死体积、改善大鼠神经功能评分以及抑制脑缺血再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡。

大鼠神经功能评分的改善及梗死体积的减少，可能与曲克芦丁改善神经元代谢，影响其呼吸链，激活脑内神经递质和酶的活性，改善脑细胞缺血状态有关[7-8]。但本研究显示，该药的神经保护作用与其对缺血再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡的抑制有关。本实验结果显示，大鼠大脑中动脉闭塞1 h再灌注23 h后，缺血脑组织Caspase 3、Caspase 8水平显著升高，提示脑缺血再灌注损伤可强烈诱导神经细胞凋亡。已经有研究报道，脑缺血损伤所致的神经细胞凋亡由Caspases激活所决定，脑缺血损伤可诱导线粒体释放细胞色素C、凋亡诱导因子促凋亡因子，破坏电子传递、氧化磷酸化和ATP，激活Caspase 8，继而激活Caspase 3，引起“瀑布式”连锁反应，最终引起神经细胞凋亡[9]。已有证据表明[10]，抑制Caspase 3的活化可以减轻以细胞凋亡为主要机制的缺血后细胞损害，增加存活神经元数量，缩小脑梗死体积，并最终改善神经功能。

另外，在神经细胞中，Caspase 1可以通过激活Caspase 6引起细胞凋亡[11]；Caspase 1还可参与白介素(interleukin，IL)-1β及IL-18的活化，继而诱导IL-6、IL-8的发生，从而引起细胞因子的释放，促进组织破坏。

本实验中，MCAO/R+TC组脑组织Caspase 1的表达较MCAO/R降低，从而证实复方曲肽注射液能够减少缺血再灌注损伤所引起的神经细胞凋亡。其机制可能与曲克芦丁消除炎症反应，减少炎症介质的释放，从而降低凋亡因子的表达有关。这与先前研究报道[12]的曲克芦丁可用于治疗梗死及脑血管疾病，其机制可能与其消除局部炎症反应有关相一致。并且已有研究证实，曲克芦丁显著抑制血小板黏附到红细胞，抑制血小板激活因子，保护内皮细胞而起到抗血栓的作用[13]。

本研究证实，复方曲肽注射液对脑缺血损伤所致凋亡相关基因表达有较明显的干预作用，由于促凋亡基因活性下降，细胞凋亡受到抑制，是这种药物发挥脑缺血损伤保护作用的途径之一。复方曲肽注射液通过对凋亡因子的下调作用进而有效缓解脑缺血损伤所致的神经元凋亡，该发现为脑缺血的临床用药治疗提供了一定的理论依据。

【参考文献】

[1]Janardhan V，Qureshi AI.Mechanisms of ischemic brain injury[J].Curr Cardiol Rep，2004，6(2):117-123.

[2]王光胜，耿德勤.脑缺血/再灌注损伤机制研究进展[J].医学综述，2011，17(24):3753-3756.

[3]鲍磊，张铮.脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的研究进展[J].实用医学杂志，2009，25(3):487-489.

[4]封华，孟雅娟，于兰，等.曲克芦丁注射液的体外溶血试验研究[J].实用中西医结合临床，2008，8(1):88.

[5]陈秋晨，于兆进，孙海刚，等.复方曲肽注射液对血小板聚集和血栓形成影响的实验研究[J].中国实验血液学杂志，2011，19(1):193-196.

[6]樊华，林鹏，王丽娜.复方曲肽注射液活性测定方法的研究[J].中国药品标准，2012，13(6):425-427.

[7]雷寿平，孙小华，陈彩华.曲克芦丁脑蛋白水解物对急性脑梗塞患者神经功能和生活质量的影响[J].临床医药文献杂志，2014，1(8):1325-1326.

[8]岳原亦，张扬，张一奇.Caspase家族与细胞凋亡[J].中国医疗前沿，2011，6(6):25-26.

[9]Nijboer CH，Heijnen CJ，Groenendaal F，et al.A dual role of the NF-κB pathway in neonatal hypoxic-ischemic brain damage[J].Stroke，2008，39(9):2578-2586.

[10]Himi T，Ishizaki Y，Murota S.A caspase inhibitor blocks ischaemia-induced delayed neuronal death in the gerbil [J].Eur JNeurosci，1998，10(2):777-781.

[11]邬皓晨，陈勇军，徐易尘，等.Caspase-1在炎症及程序性细胞死亡过程中的作用[J].中国细胞生物学学报，2011，32(2):182-189.

[12]Belcaro G，Errichi BM，Laurora G，etal.Treatmentof acute superficial thrombosis and follow-up by computerized thermography[J].Vasa，1989，18(3):227-234.

[13]周昌奎，吴晓华.曲克芦丁临床研究新进展[J].中国生化药物杂志，2005，26(5):317-319.

Neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischem ia

LIRuolin1，LIYanfang1，LIU Fang1，YANGWen1，LU Ranran1，ZHONG Shanshan1，ZHU Zhe1，WANG Xiaoqian1，YU Yingxin2，REN Ming2，QIXiaokun2
(1.Weifang Medical University，Weifang Shandong 261053，China；2.Department of Neurology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

[Abstract]Objective To investigate the neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischmia injury.M ethods Male SD rats were divided into 3 groups(n=10):normal control group(NC)，middle cerebral artery occlusion reperfusion(MCAO/R)group，MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)group(MCAO/R+TC). One hour after ischemia and 23 hours after reperfusion，6 rats in each group were evaluated by neural function test and magnetic resonance imaging(MRI)，and then sacrificed for determining the cerebral infarction volumewith 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining；the remaining 4 rats in each group were sacrificed，and the protein levels of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in the ischemia penumbrawere determined byWestern Blotting.Results After MCAO/R，cerebral infarction and neurological deficitweremanifested.Troxerutin and cerebroprotein was proved to be effective in improving neurological functions and decreasing infarction on MCAO/R animals.Compared with MCAO/R groups，the expression of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in NC groupswere decreased significantly(P＜0.05).Conclusion Troxerutin and cerebroprotein has protective effect against injury induced by cerebral ischemia reperfusion，which is related to their role in inhibiting the neuronal apoptosis.

[Key words]Cerebral ischemia；Troxerutin and cerebroprotein；Cell apoptosis；2，3，5-triphenyltetrazolium chloride

(收稿日期:2015-12-26 本文编辑:冯 博)

[通讯作者]戚晓昆，E-mail:bjqxk@sina.com

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.003

[中图分类号]R743.31

[文献标志码]A

[文章编号]2095-3097(2016)01-0009-05