分子印迹复合膜对降糖药的拉曼光谱快速检测

贾　华，尹瑞林*，钟　旭，薛　敏，赵　瑜，孟子晖，汪群杰

( 1.北京理工大学化工与环境学院，北京100081; 2.天津博纳艾杰尔科技有限公司，天津300462; 3.中国食品药品检定研究院，北京100050)



分子印迹复合膜对降糖药的拉曼光谱快速检测

贾华1，尹瑞林1*，钟旭2，薛敏1，赵瑜3，孟子晖1，汪群杰2

( 1.北京理工大学化工与环境学院，北京100081; 2.天津博纳艾杰尔科技有限公司，天津300462; 3.中国食品药品检定研究院，北京100050)

摘要基于分子印迹技术的特异性识别特点，以假模板盐酸胍和4-( 2-氨乙基)苯磺酰胺制备了2种分子印迹复合膜，用其对保健品中的二甲双胍、苯乙双胍和格列本脲进行吸附后，采用拉曼光谱法实现了保健品中降糖药的富集与快速检测.考察了膜制备过程中纳米银的加入对拉曼光谱的增强作用，以及吸附样品浓度等的影响.实验结果表明，盐酸胍分子印迹复合膜吸附5 mg/mL以上的二甲双胍或苯乙双胍后具有明显的拉曼响应，4-( 2-氨乙基)苯磺酰胺印迹膜吸附10 mg/mL格列本脲后具有明显的拉曼响应.所建立的分子印迹复合膜结合拉曼光谱检测方法可用于多种实际样品的检测.

关键词保健品;降糖药;分子印迹复合膜;纳米银;拉曼光谱

*现在北京101中学.

近年来，糖尿病人日益增多，患者在选择药物治疗的同时常选择一些保健品以增强自身的抵抗力.在众多的降糖药中，双胍类、磺酰脲类降糖药一般用于治疗Ⅱ型糖尿病，其中二甲双胍、苯乙双胍和格列本脲等降糖药因价格低廉、降糖效果明显，常被添加到保健品中以提高其降糖效果.杨钊等［1］检测了15批降糖类产品，其中有11批添加了化学药，添加次数最多的是盐酸苯乙双胍和格列本脲;张穗等［2］检测了16批降血糖药，其中4批掺有西药格列本脲; Zhou等［3］检测了5种草药补充剂，在2种补充剂中发现二甲双胍.长期摄入二甲双胍和苯乙双胍会引起乳酸血症，苯乙双胍已被许多国家禁止使用;摄入格列本脲可造成低血糖症以及肾上腺皮质功能减退、致畸等严重不良反应［4］.因此，有必要建立一种对保健品中非法添加的双胍类以及磺酰脲类降糖药物进行快速筛查的科学方法.

目前，检测降糖药物最常用的方法是高效液相色谱( HPLC)法［5～8］.曾茂法等［9］开发了同时检测格列本脲、盐酸苯乙双胍、盐酸二甲双胍和甲苯磺丁脲4种降糖药的液相色谱法.分子印迹技术原理类似于“抗原-抗体”，得到的产物为分子印迹聚合物，可对目标分子特异性识别.为了提高特异性，Feng等［10］将分子印迹与紫外检测相结合对人血浆中二甲双胍进行检测，检出限为0. 8 μg/mL.RymLahsini等［11］将分子印迹技术与高效液相色谱相结合，制得的分子印迹聚合物对格列本脲有较高的特异性吸附作用，并可对其进行痕量检测，回收率达87. 1%.Liu等［12］将分子印迹技术与化学发光检测相结合，发现苯乙双胍浓度在0. 09～2. 0 μg/mL范围内与化学发光响应信号呈线性关系，检出限可达0. 031 μg/mL.传统的印迹聚合物需要粉碎、研磨及过筛等诸多过程，若将聚合物制作在膜载体上则可简化过程.除了色谱方法外，红外光谱［13］和拉曼光谱等［14～17］方法也被用于药物检测.拉曼光谱法因灵敏度较高、样品信息丰富、使用方便、不损坏样品、样品用量少和能快速检测等特点而被广泛应用，但在复杂基质或者痕量物质的体系中，由于信号较弱，使得拉曼光谱法受到一定限制.基于金属的等离子共振效应，附着在粗糙金属(如金、银)表面的物质的拉曼散射可显著增强，可明显提高表面增强拉曼散射的灵敏度.本文将分子印迹技术( MIT)、膜技术［18，19］及拉曼光谱法相结合，采用纳米银分子印迹膜对目标化合物富集后，用拉曼光谱进行检测，实现了对保健品中双胍类以及磺酰脲类药物的富集及快速检测.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

盐酸二甲双胍和格列本脲(纯度98%，北京偶合科技有限公司) ;盐酸苯乙双胍片和盐酸苯乙双胍(纯度99. 7%，山东仁和堂药业有限公司) ;偶氮二异庚腈( ABVN，纯度97%，国药集团化学试剂有限公司) ;盐酸胍(纯度＞98%)、丙烯酸( AA，纯度＞99%)和三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( TRIM，纯度＞90%，TCI化成工业发展有限公司)，使用前经活性炭吸附处理以除去阻聚剂; 4-( 2-氨乙基) -苯磺酰胺(纯度99%，阿拉丁试剂有限公司) ;丙烯酰胺( AM，纯度＞99. 9%，美国Amresco公司) ;盐酸二甲双胍肠溶片(贵州天安药业股份有限公司) ;乙醇、乙腈和甲苯(分析纯，北京化工厂).

S-4800型扫描电子显微镜( SEM，日本Hitachi公司) ; BWS465-785S型拉曼光谱仪i-Ramanplus系列(美国BWTEK公司)，激发波长785 nm，光谱范围175～3200 cm－1，激光功率＜300 mW，最高分辨率4. 5 cm－1; UV-4802S型紫外-可见分光光度计(尤尼柯上海仪器公司) ; AWL-0502-U型超纯水系统(艾科浦公司).

1.2实验过程

1.2.1纳米银溶胶的制备参照文献［20］方法，将90 mg硝酸银溶于500 mL水中，煮沸，然后加入10 mL 1%(质量分数)的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态1 h，冷却后待用.

1.2.2盐酸胍印迹膜( MIM)和盐酸胍-纳米银印迹膜( MIM-Ag)的制备将0. 0487 g( 0. 5 mmol)盐酸胍加入5 mL乙醇和5 mL乙腈的混合溶剂中，超声溶解;加入0. 1 g引发剂ABVN，超声溶解.依次加入1 mL纳米银溶胶、0. 416 mL( 6 mmol) AA、3. 527 mL( 10 mmol) TRIM和5 mL甲苯，通氮气10 min除氧后，倒入放有滤纸( 10 cm×12 cm)的培养皿中，用保鲜膜密封，置于4℃冰箱中30 min;取出后，将滤纸置于2块玻璃板之间，置于紫外灯下光聚合反应12 h，取出晾干.用甲醇/乙酸(体积比8∶2)溶液洗模板72 h，最后用甲醇洗涤，即得MIM-Ag膜.MIM的制备方法与MIM-Ag相同，仅将1 mL纳米银溶胶换成1 mL水.

1.2.3 4-( 2-氨乙基) -苯磺酰胺-纳米银印迹膜( B-MIM-Ag)的制备将0. 1011 g( 0. 5 mmol) 4-( 2-氨乙基) -苯磺酰胺加入5 mL乙醇和5 mL乙腈的混合溶剂中，超声溶解;加入0. 1 g引发剂ABVN和0. 4352 g( 6 mmol) AM，超声溶解.按顺序加入1 mL纳米银溶胶、3. 527 mL( 10 mmol) TRIM和5 mL甲苯，通氮气10 min除氧后，倒入放有滤纸( 10 cm×12 cm)的培养皿中，用保鲜膜密封，置于4℃冰箱中30 min;取出后，将滤纸置于2块玻璃板之间，置于紫外灯下光聚合反应12 h后，取出晾干.用甲醇/乙酸(体积比8∶2)溶液清洗模板72 h，再用甲醇洗涤，即得到B-MIM-Ag膜.

1.2.4溶液的配制取6片盐酸二甲双胍肠溶片( 0. 25 g/片，以盐酸二甲双胍计)和60片盐酸苯乙双胍肠溶片( 0. 025 g/片，以盐酸苯乙双胍计)研磨成粉末状，分别加入装有20 mL超纯水的离心管中，漩涡混匀，超声提取30 min，离心后取上层清液得75 mg/mL的盐酸二甲双胍溶液和75 mg/mL的苯乙双胍溶液.将其稀释至不同浓度的溶液备用.将375 mg格列本脲标准品置于烧杯中，用甲醇/乙腈(体积比1∶1)溶解，然后转移至25 mL容量瓶中，制得15 mg/mL的格列本脲溶液.

1.2.5吸附实验将制备的膜材料裁剪成3 mm×3 mm大小，将其放入1 mL被吸附溶液中，于旋转培养器上振荡吸附15 min后取出，晾干后进行拉曼光谱检测.

1.2.6拉曼光谱检测将吸附样品后的膜晾干，在激光波长785 nm，激光功率300 mW，扫描时间10 s，扫描5次条件下进行拉曼光谱检测.在同样条件下对二甲双胍、苯乙双胍和格列本脲标准品固体进行检测作为参考.

1.2.7实际样品的前处理取1粒含有二甲双胍和苯乙双胍的某保健品胶囊(批准号: JC1012998)内容物置于离心管中，加入5 mL超纯水，超声提取30 min，离心，取上层清液，加入100 mg石墨化碳填料和50 mg C18填料，振荡30 min，离心，取上层清液，经0. 22 μm尼龙膜过滤，用于MIM-Ag膜吸附.

取半粒可能含有格列本脲的某保健品胶囊(批准号: JC1300635)内容物置于离心管中，加入200 mg石墨化碳填料和2. 5 mL甲醇/乙腈(体积比1∶1)混合溶液，超声提取15 min，离心，取上层清液，用0. 22 μm尼龙膜过滤.加标实验除了加入25 mg格列本脲以外，其它步骤相同.

2　结果与讨论

分子印迹技术( MIT)通常以目标分子为模板分子制备印迹聚合物，可对目标分子起到特异性识别的分离与富集的作用.一些性质不稳定、价格昂贵或含有可交联聚合官能团的化合物则不适于用作模板分子.另外，为避免模板泄露［21，22］，通常使用结构与目标分子相似的化合物作为假模板［23～25］分子来制备聚合物.本文在制作印迹膜时，采用假模板盐酸胍实现对保健品中盐酸二甲双胍、苯乙双胍的识别，采用4-( 2-氨乙基) -苯磺酰胺实现对保健品中格列本脲的识别，其化学结构如图1所示.

Fig.1　Chemical structures of dummy templates and anti-diabetic drugs

2.1纳米银的表征

纳米银的紫外-可见吸收光谱可以反映其颗粒大小、粒径分布以及形状等信息［26］.谱峰的吸收波长越大，表明粒子的粒径越大;较窄的半峰宽说明粒子分布比较均匀;而谱峰的个数则可以反映粒子的形状，如球形粒子有1个吸收峰，棒状粒子则有2个吸收峰.本实验中，在扣除超纯水本底的情况下，对纳米银溶胶进行紫外检测，结果如图2所示.可见，制得的纳米银颗粒在446 nm处有最大吸收，在200～900 nm之间只有1个吸收峰，说明粒子为球形;半峰宽较窄，说明粒径分布比较均匀.扫描电子显微镜照片(图3)进一步表明制备制得的纳米粒子为球形，且粒径分布较均匀.

Fig.2　UV-Vis spectrum of nano-silver particles

Fig.3　SEM image of nano-silver particles

2.2 MIM和MIM-Ag的表征及应用

2.2.1形貌表征用扫描电子显微镜对基质滤纸、MIM和MIM-Ag分别进行测试，结果如图4所示.可见，基质滤纸的形貌与MIM及MIM-Ag的形貌完全不同，在MIM及MIM-Ag的SEM照片中存在明显的聚合物，且有较多的孔洞结构，证明MIM及MIM-Ag膜材料已成功制备.

2.2.2纳米银对拉曼检测信号的影响为了考察在膜制备过程中纳米银溶胶的加入对拉曼光谱信号的影响，采用MIM和MIM-Ag膜材料进行吸附实验并进行对比，结果如图5所示.

Fig.4　SEM images of membrane matrix( A)，MIM( B) and MIM-Ag( C)

Fig.5　Raman spectra of metformin hydrochloride( A)，MIM( a，c) and MIM-Ag( b，d) before( a，b) and after( c，d) adsorption of 75 mg/mL metformin hydrochloride( B)

图5( A)为盐酸二甲双胍标准品晶体的拉曼谱图，图5( B)为MIM材料和MIM-Ag材料分别吸附75 mg/mL的盐酸二甲双胍片提取液后的拉曼光谱图(谱线c，d)，未吸附的MIM和MIM-Ag材料的拉曼谱图如谱线a和b所示.对比图5( A)和图5( B)可知，2种膜吸附相同浓度的二甲双胍后，在盐酸二甲双胍标准品信号较强的位置处( 737. 48 cm－1)出现不同强度的响应信号，由放大图［图5( B)插图］可见，MIM-Ag材料的拉曼信号远比MIM材料的拉曼信号强，证明纳米银的加入对于膜的拉曼响应具有一定的增强作用，因此选用MIM-Ag膜进行后续研究.

Fig.6　Raman spectrum of phenformin hydrochloride

2.2.3 MIM-Ag对二甲双胍与苯乙双胍的吸附用MIM-Ag膜吸附不同浓度二甲双胍和苯乙双胍标准溶液后，对膜进行拉曼光谱检测.图6为苯乙双胍标准品粉末的拉曼谱图，在1202. 56，1030. 83和1002. 21 cm－1处有较强响应.图7( A)为MIM-Ag膜材料吸附不同浓度的二甲双胍水溶液后的谱图，在736. 60 cm－1处有响应，随着吸附浓度的增大，拉曼信号也随之增强，而未吸附的MIM-Ag在此处并未出现相应的信号，证明MIM-Ag可以实现对盐酸二甲双胍的吸附，吸附5 mg/mL的二甲双胍溶液后的MIM-Ag仍具有拉曼响应.图7( B)为MIM-Ag膜材料吸附不同浓度的盐酸苯乙双胍水溶液的谱图，在1202. 56和1002. 21 cm－1处的拉曼信号随着吸附浓度的增大而增强，而未吸附的MIM-Ag在1202. 56，1030. 83和1002. 21 cm－1处并未出现相应的信号，证明MIM-Ag同样可实现对苯乙双胍的吸附，吸附5 mg/mL的苯乙双胍溶液后的MIM-Ag仍可检测得到拉曼信号.

2.2.4实际样品中二甲双胍与苯乙双胍的检测为了考察MIM-Ag材料在实际样品检测中的效果，将其对保健品(批准号: JC1012998)提取液吸附后进行拉曼光谱检测.将用MIM-Ag材料吸附样品JC1012998提取液后与吸附前以及二甲双胍标准品和苯乙双胍标准品固体的拉曼谱图进行对比(图8)发现，在736. 60 cm－1处(峰3)吸附后有拉曼响应，吸附前则没有响应，证明样品JC1012998中含有盐酸二甲双胍.在1030. 83和1202. 56 cm－1(峰1和峰2)处，吸附后有明显的拉曼响应，吸附前则没有响应，证明样品JC1012998中也含有盐酸苯乙双胍.为了验证MIM-Ag吸附后所出现的峰并非由药物中其它物质引起，将吸附后的MIM-Ag膜材料用甲醇洗脱，洗脱液经液相色谱验证，仅存在二甲双胍和苯乙双胍.同时对洗脱后的MIM-Ag进行拉曼光谱检测，发现洗脱后MIM-Ag的拉曼谱图与未吸附的MIM-Ag差别不大.

Fig.7　Raman spectra of MIM-Ag before and after adsorption of different concentrations of metformin hydrochloride( A) and phenformin hydrochloride( B) a.MIM-Ag( before adsorption) ; concentration/( mg·mL－1)，b—g: 5，9，19，38，75，100.

Fig.8　Raman spectra of MIM-Ag before( a) and after ( b) adsorption of a real sample ( No.JC1012998) extract

Fig.9　Raman spectra of MIM-Ag after adsorption of a real sample( No.JC1012998) extract( a) and rinsed with chloroform( b)

2.2.5 MIM-Ag吸附后溶剂冲洗的影响为了证明MIM-Ag材料吸附实际样品后，是因为其内部具有吸附功能而非由于物理作用导致二甲双胍或苯乙双胍停留在膜的表面，将吸附样品JC1012998提取液后的MIM-Ag用氯仿冲洗后再进行检测.对比图9与图8可见，无论在MIM-Ag吸附后是否用氯仿冲洗，检测结果一致，即均可用736. 60 cm－1处的峰判别实际样品中是否存在二甲双胍，用1202. 56和1030. 83 cm－1处的峰判别实际样品中是否存在苯乙双胍.此结果表明，MIM-Ag不是因为表面对二甲双胍或苯乙双胍的吸附而被检测到，而是因为MIM-Ag内部有与二甲双胍和苯乙双胍类似的空穴结构，SEM照片也可证实此结论.

2.3 B-MIM-Ag的性能评估

2.3.1 B-MIM-Ag对格列本脲标准品的检测用B-MIM-Ag材料对格列本脲的甲醇/乙腈(体积比1∶1)溶液( 15 mg/mL)进行吸附并检测，结果如图10所示.图10( A)为格列本脲标准品粉末的拉曼谱图，图10( B)为B-MIM-Ag膜材料吸附格列本脲溶液后的谱图.对照标准品谱图可见，在1592. 50和1156. 05 cm－1处，吸附后的拉曼信号有极大增强，可以依据这2个峰来判断B-MIM-Ag是否吸附了格列本脲，从而实现对格列本脲的吸附与检测.

Fig.10　Raman spectra of glibenclamide( A) and B-MIM-Ag before( a) and after adsorption( b—d) ( B) ( B) b—d.B-MIM-Ag adsorbs 5，12 and 15 mg/mL gibenciamide，respectively.

2.3.2 B-MIM-Ag对实际样品的检测用B-MIM-Ag材料对保健品(批准号: JC1300635)提取液吸附后的拉曼光谱图如图11所示.可见，B-MIM-Ag吸附样品提取液后的拉曼信号与吸附前比较，在格列本脲1592. 50 cm－1处的特征峰位置无明显变化，仅在1156. 05 cm－1处有峰出现，因此无法证明该胶囊中是否添加了格列本脲.为了证明方法的可靠性，对样品提取液进行加标( 10 mg/mL)测定，由图11谱线c可见，在1592. 50和1156. 05 cm－1处都有峰出现，证明B-MIM-Ag对格列本脲的吸附检测方法可靠.

Fig.11　Raman spectra of B-MIM-Ag before ( a) and after adsorption of a real sample ( No.JC1300635)　extract( b)　and　after adsorption of the sample( No.JC1300635) extract added standard( c)

此外，在所检测药品JC1300636，JC1012974和BC201300380中均可检测到盐酸二甲双胍的存在，但并未能检测到苯乙双胍和格列本脲，原因可能有2种: ( 1)不存在苯乙双胍或者格列本脲; ( 2)苯乙双胍或者格列本脲的量太少以致无法检出.

综上所述，将分子印迹技术与拉曼光谱检测相结合，实现了对特定目标物的快速检测.基于分子印迹以及膜技术，制备了MIM-Ag及B-MIM-Ag材料，其中纳米银的加入对于拉曼信号有明显的增强作用.用MIM-Ag材料吸附不同浓度的二甲双胍或苯乙双胍，随着其浓度的增大，拉曼信号增强.将膜材料应用于实际样品检测，MIM-Ag对二甲双胍和苯乙双胍的检测获得了较好的效果，但B-MIM-Ag对于格列本脲的检测效果不佳，可能是降糖药中的格列本脲含量较低所致，期待能进一步降低检出限.

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Anti-diabetic Drugs Detection by Raman Spectrometry with Molecular Imprinted Composite Membrane†

JIA Hua1，YIN Ruilin1，ZHONG Xu2，XUE Min1*，ZHAO Yu3，MENG Zihui1*，WANG Qunjie2
( 1.School of Chemical＆Environmental Engineering，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China;
2.Bonna-Agela Technologies，Tianjin 300462，China;
3.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China)

†Supported by the National Natural Science Foundation of China( No.21375009).

Abstract Some artificially synthesized anti-diabetic drugs are frequently found in health products to enhance their curative efficacy.Based on the specific recognition characteristics of molecularly imprinted technology，two kinds of molecularly imprinted composite membranes were prepared with dummy template of guanidine hydrochloride and 4-( 2-aminoethyl) -benzene sulfonamide.The adsorption capacities of these two membranes to metformin hydrochloride，phenformin hydrochloride and glibenclamide were studied.Meanwhile，surface enhancement Raman spectrometry( SERS) to determine the target chemicals was established and employed in the membrane detection after infiltrated in the health products extract solution.The influence of nano-silver particles on the membrane to SERS was also studied.The detection limits of metformin hydrochloride，phenformin hydrochloride and glibenclamide are 5，5 and 10 mg/mL，respectively.This method was also proved by several pieces of real samples.

Keywords Health care product; Anti-diabetic drug; Molecularly imprinted membrane; Nano-silver; Raman spectroscopy

( Ed.: N，K)

基金项目:国家自然科学基金(批准号: 21375009)资助.

收稿日期:2015-07-09.网络出版日期: 2015-12-26.

doi:10.7503/cjcu20150533

中图分类号O657.37

文献标志码A

联系人简介:薛敏，女，博士，讲师，主要从事样品前处理和色谱分析方面的研究.E-mail: minxue@ bit.edu.cn孟子晖，男，博士，教授，博士生导师，主要从事光子晶体方面的研究.E-mail: m_zihui@ yahoo.com