多指标正交试验法优选小续命汤水提工艺＊

王仁杰，周恩丽，李 淼，秦建平，吴 云，孙永成，杜冠华，萧 伟＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室连云港 222001；3. 中国医学科学院药物研究所 北京 100050）

多指标正交试验法优选小续命汤水提工艺＊

王仁杰1,2，周恩丽1,2，李 淼1,2，秦建平1,2，吴 云1,2，孙永成1,2，杜冠华3，萧 伟1,2＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室连云港 222001；3. 中国医学科学院药物研究所 北京 100050）

目的：优选小续命汤的水提工艺。方法：以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率以及水提物的浸膏得率为综合评价指标，选取加水量、提取时间、提取次数为考察因素，采用正交试验法优选小续命汤的水提工艺。结果：最佳回流提取工艺为10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h。结论：该优选工艺客观可行、合理稳定，可为小续命汤的产业化研究提供实验依据。

多指标成分 升麻素苷 5-O-甲基维斯阿米醇苷 苦杏仁苷 综合评价 小续命汤 熵权法

“小续命汤”始载于《备急千金要方》（唐·孙思邈），该方具有“温经通阳，扶正驱风”的功能，主治“正气虚弱，风寒初中经络所致半身不遂，口眼歪斜，语音失利，筋脉拘急，头痛颈强等”，主要用于治疗中风及中风后遗症，具有显著的临床疗效，且应用广泛。本公司在该古方的现代研究[1-7]基础之上开发了一款新型口服制剂产品，用于脑中风恢复期治疗。该方由麻黄、桂枝、防风、苦杏仁、人参、白芍、防己等12味中药组成，处方中麻黄、桂枝、防风、苦杏仁所含有效成分主要是升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷以及麻黄碱等成分，易溶于水[8-10]。通过前期药效筛选试验，确定了这4味药的水提工艺。为了最大限度地提取出以上有效成分，充分发挥其功效，本试验考虑采用水煎煮回流提取小续命汤的水溶性成分，选取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取率以及浸膏得率为综合评分指标，采用正交试验法多指标优选小续命汤的水提工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000型液相色谱仪（美国戴安公司）；RE-300型旋转蒸发仪（上海亚荣）；JK-250DB型数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；DZTW型调温电热套（北京市永光明医疗仪器厂）；Sartorius BP 211D电子分析天平（德国Sartorius公司）；超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

麻黄（产地吉林通榆）、苦杏仁（产地甘肃灵台）、桂枝（产地广西平南）、防风（产地黑龙江杜尔百特）分别经连云港康缘大药房执业药师吴舟鉴定为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的干燥草质茎、蔷薇科植物杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子、樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝、伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根；升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111522-201008、111523-201007）；苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110820-201004）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 指标成分测定

2.1.1 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的测定方法

色谱条件：Phenomenex C18键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；检测波长254 nm；进样量：10 μL；流动相为乙腈（A）-水（B），0-20 min，A：13%→30%；流速：1.0 mL·min-1。

对照品溶液的制备：分别精密称取升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，用50%甲醇溶解制成质量浓度分别为47.05 μg·mL-1、52.05 μg·mL-1的对照品混合溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，冷藏备用。

供试品溶液的制备：精密量取待测提取液10 mL至中性氧化铝柱，用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，水浴挥干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释至刻度摇匀，0.22 μm微孔滤膜（有机膜）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

线性范围的考察：精密量取升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品混合溶液2、4、8、12、16、20 mL，按拟定色谱条件进样检测，记录色谱峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，以对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。升麻素苷：Y=1 254.245 2 X-3.542 9（R2=0.999 9），5-O-甲基维斯阿米醇苷：Y= 1 815.057 9 X-14.172 5（R2=0.999 9），表明升麻素苷在0.094 1-0.941 0 mg范围内与峰面积呈良好线性关系，5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.104 1-1.041 mg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.2 苦杏仁苷的测定方法

色谱条件：Phenomenex C18键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；检测波长210 nm；进样量：10 μL；流动相：甲醇-1%磷酸水溶液（21:79）；流速1.0 mL·min-1。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，用50%甲醇溶解制成质量浓度为160.60 μg·mL-1的对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，冷藏备用。

供试品溶液的制备：精密量取待测提取液10 mL至中性氧化铝柱，用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，水浴挥干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释至刻度摇匀，0.22 μm微孔滤膜（有机膜）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

线性范围的考察：精密吸取芍药苷对照品溶液1，3，5，10，15，20 mL，按拟定色谱条件进样检测，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，以对照品进样量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y= 980.39 X + 1.50（R2=0.999 8），表明苦杏仁苷在0.160 6-3.212 mg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.3 方法学考察

（1）精密度考察

精密量取升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品溶液、苦杏仁苷对照品溶液，分别按照各自色谱条件连续进样6次，每次进样10 μL，测定峰面积，结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分别为0.35%、0.65%、0.96%，表明仪器精密度较高。

（2）稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h注入液相色谱仪，记录各自的峰面积值。结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分别为1.4%、1.6%、1.4%，表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

（3）重复性试验

精密量取待测提取液10 mL，平行量取6份，按拟定供试品溶液制备方法制备供试品溶液12份，每份精密吸取10 μL，分别按拟定的色谱条件进行测定。结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分别为0.72%、0.45%、0.56%，表明方法重复性良好。

（4）加样回收试验

精密量取已知含量的提取液6份，每份5 mL，分别精密加入升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品溶液、苦杏仁苷对照品溶液1.0 mL，按2.1.1和2.1.2项下方法制备供试品溶液，按各自项下拟定色谱条件进行测定，计算升麻素苷的平均回收率99.24%，RSD 0.68%, 5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均回收率99.43%，RSD 0.87%，苦杏仁苷的平均回收率99.25%，RSD 0.76%，表明本法回收率良好。

2.1.4 浸膏得率测定

精密量取待测样品V1（mL），置于已恒重蒸发皿中（M1），在105℃烘箱内干燥至恒重，取出置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称重（M2），计算浸膏得率。公式如下：

m为待测样品中药材总质量，V2为待测样品总体积

2.2 基于信息熵理论的小续命汤水提工艺评价2.2.1 小续命汤水提工艺正交试验

在相关文献[11-16]基础上结合预实验，选取加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，称取麻黄30 g、苦杏仁90 g、桂枝30 g、防风60 g为1份，共9份，以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷提取率以及浸膏得率为综合评价指标，按L9（34）正交表进行煎煮提取。试验设计及结果见表1。

2.2.2 小续命汤水提工艺研究数据的处理

根据文献[17-19]所给出的步骤，建立原始评价指标矩阵，原始评价矩阵如下：

计算Pij，将原始评价矩阵转换为“概率”矩阵。

计算各项指标的信息熵，得到评价指标的信息熵。

计算第i项指标的权系数。

对于1个m行n列的概率矩阵，综合评价指标Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3＋…＋Pnm×Wn。

将概率矩阵的数据进行加权处理，得到综合评价指标M，再进行方差分析，以确定最优实验方案。正交试验结果见表1，方差分析见表2。

由极差分析结果可知，各因素对综合指标的影响主次顺序为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞加水量。方差分析结果表明，B、C两个因素有显著性差异，A因素无显著性差异。最终确定最佳提取工艺为A2B3C3，即加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

表1 L9（34） 正交试验设计与结果

表2 方差分析

表3 验证试验结果

2.3 验证试验

为确证该工艺的优劣和稳定性，按最佳条件提取麻黄、苦杏仁、桂枝、防风3批进行验证，测定各指标成分提取率，计算综合评分，结果见表3，RSD为0.62%。结果表明优化后的小续命汤水提工艺稳定可行。

3 讨论

依据热力学中熵的概念，把信息集的平均信息量称为信息熵[20]。在信息论中，信息熵是系统不确定性和无序性的度量。该理论用于多指标综合评价时，相当于将每个评价指标作为1个随机变量，通过计算各指标的信息熵，从而给出各个指标的不同权重。对于一项评价指标，其取值变异程度越大，指标越有序，信息熵就越小，其提供的信息量越多，该指标就越重要，所占权重系数相应地就越大[18]。信息熵理论在多属性决策问题中的应用属于客观赋权法的一种，经过对实验数据的整理、计算和分析，得到的权重系数，可靠性更高。

本研究选取小续命汤水提组药材中的已知有效成分：升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率，加上水提物浸膏得率作为多指标进行综合评价，可较为全面地评判所筛选工艺的优劣。

在数据处理时，采用信息熵权重分析法对各指标进行客观赋权。与主观赋权法相比[21-23]，权重数据完全来自于对实验数据的数理分析，清晰地反映了指标成分在不同提取条件下变化的客观规律。分析结果更为科学、客观，所优选的工艺合理、稳定、可行，可为小续命汤的产业化研究提供实验依据。

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Optimum Water Extraction Method for Xiaoxuming Decoction via Multi-Target Orthogonal Design

Wang Renjie1,2, Zhou Enli1,2, Li Miao1,2, Qin Jianping1,2, Wu Yun1,2, Sun Yongcheng1,2, Du Guanhua3, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China)

This study aimed to optimize the water extraction method for Xiaoxuming decoction through multitarget orthogonal experiment. The comprehensive evaluation indexes included the extraction percentages of prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol and amygdalin from water. The volume of water, extraction duration, and extraction frequency were crucial indexes for orthogonal design. It was found that optimum extraction parameters included three times of refluxing extraction with ten folds water, and 1.5 h for each time. In conclusion, this optimum extraction process was stable, practical and reasonable in the area of industrial production, and laid a fundamental for the water extraction method exploration of Xiaoxuming decoction.

Multi-target components, prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol, amygdalin, comprehensive evaluation, Xiaoxuming decoction, entropy method

10.11842/wst.2016.04.017

R283.6

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-01-31

修回日期：2015-03-16

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药制剂和创新中药的研究与开发。