四君子汤多糖分离纯化对IEC-6细胞迁移药效活性的影响＊

邓 娇，李茹柳，蔡佳仲，涂小华，陈蔚文

（广州中医药大学脾胃研究所 广州 510006）

四君子汤多糖分离纯化对IEC-6细胞迁移药效活性的影响＊

邓 娇，李茹柳＊＊，蔡佳仲，涂小华，陈蔚文

（广州中医药大学脾胃研究所 广州 510006）

目的：本研究对四君子汤多糖进行提取和分离纯化，观察不同多糖样品对小肠上皮细胞（IEC-6）迁移的影响，从而进行多糖纯化过程的药效活性追踪，为探讨四君子汤多糖药效物质基础提供参考。方法：①四君子汤水提醇沉得到四君子汤多糖1；经Sevag法去蛋白得到四君子汤多糖2；经DEAE-52纤维素柱层析并超纯水洗脱得到四君子汤多糖3a；经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析并超纯水洗脱得到四君子汤多糖4a和多糖4b；并以苯酚-硫酸法检测各多糖样品糖含量（以葡萄糖计）。②凝胶渗透色谱法（GPC）检测四君子汤多糖3a、多糖4a和多糖4b纯度。③在IEC-6细胞迁移模型上，观察四君子汤多糖不同样品促进细胞迁移的药效活性。结果：4种多糖样品（四君子汤多糖1、2、3a、4b）糖含量分别为71.35%、75.45%、81.00%和98.50%，其促进细胞迁移的最低有效剂量分别为200、100、50、30 mg·L-1；表明纯化步骤最多的多糖4b糖含量最高、药效最优，且GPC法测得其为均一性多糖组分。结论：四君子汤多糖经不同纯化步骤后，糖含量和纯度提高，药效活性随之增强，研究结果为探讨四君子汤促进细胞迁移的药效物质基础研究提供参考。

四君子汤多糖 分离纯化 IEC-6细胞 细胞迁移

四君子汤有益气健脾之功效，用于脾胃气虚、胃纳不佳、食少便溏者[1]。研究表明四君子汤有防治胃肠粘膜损伤、促进消化吸收、调节胃肠运动及胃肠激素、增强肠道免疫等作用[2]。胃肠粘膜损伤是胃肠病变的常见病理基础，而上皮细胞迁移是胃肠粘膜损伤修复的重要步骤[3]。研究发现四君子汤总多糖对小肠上皮细胞（Intestinal Epithelial Cells-6，IEC-6）迁移有促进作用，且药效优于组成四君子汤的各单味药多糖[4]。本课题组研究发现，四君子汤对应激性溃疡大鼠胃粘膜损伤有防治作用，药效机制可能与其增加胃和小肠粘膜多胺（精脒）有关[5]。本文在此基础上，对四君子汤多糖进行提取分离纯化，并在IEC-6细胞迁移模型上，对四君子汤多糖不同样品进行促进细胞迁移的药效活性追踪，探讨四君子汤多糖促进细胞迁移的活性组分，为研究四君子汤胃肠粘膜损伤修复的药效物质提供参考。

1 实验材料

1.1 药材

人参为五加科植物Panax ginseng C.A.Mey.干燥根和根茎，3-4年生；白术为菊科植物Atractylodes macrocephala Koidz.干燥根茎，炒制；茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos (Schw.) Wolf.干燥菌核；甘草为豆科植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根，蜜炙；购于广州同康药业有限公司，由广州中医药大学中药鉴定教研室童家赟讲师鉴定。

1.2 试剂

胎牛血清（批号：1671324），高糖DMEM（批号：8115346），双抗Pen Strep（批号：1677648），均为美国gibco公司产品；DEAE-52纤维素填料（英国Whatman公司，批号：10226431）；Sephadex G-100（瑞典GE Healthcare公司，批号：10107207）；S0208 TSK gel column（日本TOSOH公司，7.8 mm ×300 mm）；其它试剂均为分析纯。

1.3 仪器

IX-71型荧光倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Waters 2695 高效液相色谱仪及2414型示差折光检测器（美国Waters公司）；3111型CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）；R206型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；DLSB3030型低温冷转循环泵、SHB III D型循环水式多用真空泵和W201D型恒温水浴锅（郑州长盛实验仪器有限公司）；VirTis冻干机（珠海市造鑫企业有限公司）；MVLTIF型离心机（美国Thermo Scientific公司）；UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司）；DZF6050型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；2XZ(S)4型旋片式真空泵（上海德英真空照明设备有限公司）；BSZ-100自动部分收集器（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.4 细胞

大鼠小肠隐窝细胞（IEC-6）购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），批号：58541019。

2 方法与结果

2.1 四君子汤多糖样品制备及含量检测

2.1.1 四君子汤多糖1（以下简称“多糖1”）的制备及含量检测

称取人参、茯苓、白术、甘草药材各300 g，粉碎，加入12倍量水（7.2 L），加热提取2 h，纱布过滤，取滤液；药渣按同法提取第2次，合并2次滤液，减压浓缩至1.4 L，加乙醇至含醇量为75%，4 ℃静置过夜，抽滤，沉淀溶于约1.6 L超纯水，离心（8 400 rpm，15 min），取上清液，冷冻干燥得多糖1（68.18 g，相对于药材得率为5.7%）；分光光度计以苯酚-硫酸法测得其糖含量（以葡萄糖计）为71.4%。

2.1.2 四君子汤多糖2的制备及含量检测

多糖1以Sevag法去蛋白，氯仿与正丁醇体积比4：1配制Sevag试剂；取65 g多糖1溶于2 L纯水中，取600 mL该溶液与400 mL Sevag试剂混合后倒入萃取瓶，用力振摇20 min，静置6 h，出现上层水溶液层、中间白色蛋白层和下层有机相层，取上层水溶液；同法把溶于2 L纯水的多糖1溶液全部萃取完毕，经冷冻干燥，得四君子汤多糖2（47.7 g，相对于药材得率为4.0%），苯酚-硫酸法测得其糖含量（以葡萄糖计）为75.5%。

2.1.3 四君子汤多糖3的制备及含量检测

取“多糖2”2.15 g，经DEAE-52纤维素柱（5.2 cm ×12.0 cm）层析，依次用3倍柱体积的超纯水和0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mol·L-1NaCl溶液洗脱，流速2 mL·min-1，自动收集器收集，每管5 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测各管洗脱液多糖洗脱情况（见图1）。

图1显示，四君子汤多糖2经超纯水和0.1、0.3 mol·L-1NaCl洗脱后，各有数管洗脱液可检测到有多糖洗出；而经0.5、0.8、1.0 mol·L-1NaCl洗脱后，各管吸光度基本为0，表明其基本无多糖洗出，因此取前3者分别合并各管多糖洗脱液，分别装入透析袋，在流动的蒸馏水中透析48 h后真空干燥，得到多糖3a（本次柱层析得1.43 g，换算成1 200 g四君子汤药材累计应得“多糖3a”32.19 g，相对于药材得率为2.7%）、多糖3b（0.1 mol·L-1NaCl 洗脱部位，58.5 mg）和多糖3c（0.3 mol·L-1NaCl 洗脱部位，20 mg）。其中多糖3a所得量最高，苯酚-硫酸法测得其糖含量为81.0%，选择该样品进一步分离纯化。

2.1.4 四君子汤多糖4的制备及含量检测

取“多糖3a”350 mg，加约20 mL超纯水溶解，经Sephadex G-100凝胶柱（3.2 cm × 84.0 cm）层析，3倍柱体积超纯水洗脱，流速0.75 mL·min-1，自动收集器收集，每管5 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测各管洗脱液多糖洗脱情况（见图2）；分别合并“峰1”和“峰2”多糖洗脱液，真空干燥，得四君子汤多糖4a（78.7 mg）和多糖4b（220 mg；换算成1 200 g四君子汤药材累计应得“多糖4b”19.85 g，相对于药材得率为1.7%）；其中多糖4b（峰2）量较多，苯酚-硫酸法测得其糖含量（以葡萄糖计）为98.5%。

2.2 四君子汤多糖纯度测定

高效液相凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC）原理是根据被检测多糖的分子体积（或相对分子质量）实施分离，色谱图峰反映了化合物的相对分子质量分布，若显示为单一对称峰，表明其分子质量分布相对集中，为均一性多糖组分。以GPC法检测四君子汤多糖3a、多糖4a和多糖4b，HPLC条件：3种多糖样品分别配制成1.0 mg·mL-1溶液；柱温箱温度：30 ℃；示差折光检测器温度：30 ℃；检测器灵敏度：4；流动相：超纯水；流速：0.6 mL·min-1；进样量：20 μL。

图1 四君子汤多糖2经DEAE-52纤维素柱不同洗脱液洗脱曲线

图2 四君子汤多糖3a经Sephadex G-100凝胶柱超纯水洗脱曲线

图3 所示GPC法检测结果，多糖3a色谱图显示3个峰，主峰（第二峰）保留时间为18.28 min，峰面积占86.43%，峰形不对称，说明其为非均一性多糖组分；多糖4a色谱图主要的第一、二峰保留时间分别为8.75 min和12.87 min，与多糖3a第一峰（11.28 min）出现时间较接近，可能有多糖3a第一峰所含组分；多糖4b色谱图呈单一狭窄对称峰，保留时间为18.27 min，峰面积达98.62%，表明其为均一性多糖组分，也与多糖3a主峰保留时间很接近，提示多糖4b可能主要保留了多糖3a的主峰成分。

2.3 四君子汤各多糖样品对细胞迁移的影响[6]

细胞培养及给药方法：细胞以6.25×104cells·cm-2接种于75 cm2培养瓶，培养基为高糖DMEM加入10%FBS和2 mL双抗；培养条件为37 ℃，饱和湿度，5% CO2；待细胞生长至80%-90%时，以每孔1×106个细胞接种于6孔板，培养24 h后进行细胞迁移实验：在6孔培养板中央用手术刀片轻轻划一直线，用细胞刮刀沿直线将一侧细胞刮干净，PBS清洗2次，迅速加入培养基每孔2.5 mL；给药方法：空白组每孔加培养基2.5 mL，阳性对照药组加入含终浓度为5 μmol·L-1精脒的培养基2.5 mL，受试药加入含各剂量的四君子汤多糖不同样品；加药后培养24 h，相差倒置显微镜观察细胞越过划痕线（即细胞迁移）情况，拍照，每孔从左至右选取6-10个视野进行细胞迁移计数，统计每组3个复孔各视野的迁移细胞均数。所有数据采用均数±标准差，用SPSS 17.0软件统计，采用单因素方差分析。

表1结果显示，经水提醇沉得到的四君子汤多糖1，仅有200 mg·L-1剂量组有促进细胞迁移的作用（与空白组比较P＜0.01）。

表2结果显示，经水提醇沉和Sevag法去蛋白得到的四君子汤多糖2，100 mg·L-1和200 mg·L-1剂量组有促进细胞迁移的作用（与空白组比较P＜0.05和P＜0.01）；提示经初步纯化后四君子汤多糖药效活性可提高。

表3结果显示，经水提醇沉、去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析并超纯水洗脱后得到的四君子汤多糖3a，50、100、200 mg·L-1剂量组均有促进细胞迁移的作用（与空白组比较P＜0.01）；提示进一步纯化后的四君子汤多糖药效活性更高。

表4结果显示，经水提醇沉、去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析并超纯水洗脱后得到的四君子汤多糖4b，30 mg·L-1和60 mg·L-1剂量组有促进细胞迁移的作用（与空白组比较P＜0.01）；提示四君子汤多糖经不同纯化过程后药效活性逐步提高（见图4）。

图3 四君子汤多糖样品高效液相色谱图（示差折光检测器）

表1 四君子汤“多糖1”对细胞迁移的影响（±s）

表1 四君子汤“多糖1”对细胞迁移的影响（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01。

组别n（视野数）剂量细胞迁移数/个空白组20 --102.6±21.7精脒组18 5 μmol·L-1166.7±48.9**四君子汤多糖1组18 50 mg·L-1101.9±16.7四君子汤多糖1组18 100 mg·L-1107.9±26.6四君子汤多糖1组18 200 mg·L-1156.0±31.2**

表2 四君子汤多糖2对细胞迁移的影响（±s）

表2 四君子汤多糖2对细胞迁移的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别n（视野数）剂量细胞迁移数/个空白组19 -156.8±31.9精脒组19 5 μmol·L-1236.2±53.6**四君子汤多糖2组18 50 mg·L-1171.3±39.4四君子汤多糖2组24 100 mg·L-1203.3±53.1*四君子汤多糖2组24 200 mg·L-1273.5±62.6**

表3 四君子汤多糖3a对细胞迁移的影响（±s）

表3 四君子汤多糖3a对细胞迁移的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别n（视野数）剂量细胞迁移数/个空白组30 -201.3±22.7精脒组24 5 μmol·L-1236.9±47.2*四君子汤多糖3a组27 50 mg·L-1284.7±56.3**四君子汤多糖3a组29 100 mg·L-1268.8±49.0**四君子汤多糖3a组24 200 mg·L-1249.5±48.6**

表4 四君子汤多糖4b对细胞迁移的影响（±s，n=30）

表4 四君子汤多糖4b对细胞迁移的影响（±s，n=30）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量细胞迁移数/个空白组-196.6±28.0精脒组5 μmol·L-1234.6±41.4*四君子汤多糖4b组15 mg·L-1206.1±32.0四君子汤多糖4b组30 mg·L-1248.2±42.5**四君子汤多糖4b组60 mg·L-1240.7±32.6**

图4 四君子汤“多糖4b”对IEC-6细胞迁移的影响（×100）

3 讨论

多胺调控信号是小肠上皮细胞迁移的重要调控途径[7]，本课题组研究发现，益气健脾中药党参、白术、甘草、黄芪的提取物（如糖提取物、黄酮提取物、甲醇提取物等）有促进小肠上皮IEC-6细胞迁移的作用，作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关[6,8-16]。本实验室还对白术多糖调节IEC-6细胞迁移的活性组分进行了初步的化学结构解析[17,18]。本文在上述益气健脾单味中药研究基础上，开展益气健脾方剂提取分离纯化及药理研究。

四君子汤是益气健脾代表方，也是治疗脾虚证的基本方，出自宋《太平惠民和剂局方》：“治荣卫气虚，脏腑怯弱，心腹胀满，全不思食，肠鸣泄泻，呕噎吐逆，大宜服之。人参去芦，甘草炙，茯苓去皮，白术各等分”；本文四君子汤组成和比例遵古方（人参、白术、茯苓、炙甘草组成为1：1：1：1），四味药的化学成分复杂，但多糖是其共有的一类成分，因此选择四君子汤多糖组分为受试药，采取不同提取分离步骤以纯化四君子汤多糖，并以促进细胞迁移作为药效活性追踪指标。

本实验结果显示，经过水提醇沉、Sevag法去蛋白、DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶柱层析并超纯水洗脱等步骤，对四君子汤多糖进行提取和分离纯化后，得到的4个代表性多糖提取物——四君子汤多糖1、2、3a和4b，苯酚-硫酸法分光光度计测得其糖含量（以葡萄糖计）分别为71.35%、75.45%、81.0%和98.5%，提示经分离纯化后，四君子汤多糖的糖含量逐步提高。细胞迁移实验结果显示，多糖1、2、3a、4b促进细胞迁移的起效剂量分别为200、100、50、30 mg·L-1，表明四君子汤多糖经分离纯化后，促进细胞迁移的药效活性逐步提高，其中纯度高、药效活性较好的四君子汤多糖4b为均一性多糖组分，为后续对其进行化学结构解析提供了参考。

多糖是近年研究较多的一类中药组分（成分）[19]，如灵芝多糖、铁皮石斛多糖、鹿茸多糖等具有抗氧化活性，且药效随多糖纯度及含量的增加而升高[20-22]；松茸多糖有抗肿瘤活性，且纯化后多糖比粗多糖药效更优[23]。以上研究以药效活性为导向筛选多糖组分，结果发现随着逐步分离纯化，药效活性也随之增加。

生物活性导向分离是中药药效物质基础的重要研究方法之一[24]。张伯礼和王永炎院士指出，研究方剂要借鉴现代化学的研究方法，保持方剂的配伍特点，在研究过程始终贯彻在生物导向下的化学研究思路，努力做到药效物质与作用原理清楚，为构建以组分配伍的现代中药提供理论依据和技术支撑；并提出对方剂科学问题的认识是：方剂在病证结合、方证对应、理法方药一致的条件下，通过多组分作用在多靶点，融拮抗、补充、整合、调节等多种功效而起治疗作用[25]。

方剂的组分研究是探讨方剂科学问题的重要手段之一，本文对四君子汤多糖进行提取分离纯化及药效活性观察，为探讨四君子汤促进胃肠粘膜损伤修复的有效组分及其作用机制研究以及后续四君子汤多糖的结构解析提供了参考。

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IEC-6 Cell Migration Ability Changes is Impacted by Polysaccharides Separated and Purified from Sijunzi Decoction

Deng Jiao, Li Ruliu, Cai Jiazhong, Tu Xiaohua, Chen Weiwen
(Pi-Wei Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

This study aimed to observe the effects of different polysaccharide samples extracted, separated and purified from Sijunzi Decoction (SJZD) on migration ability of the small intestinal epithelial cells (IEC-6), and track the pharmacodynamic activities of polysaccharide in the purification process, in hoping of providing some references for the pharmacodynamic material research of SJZD. In this study, firstly, the pharmaceutical chemicals of the SJZD were extracted by different purification methods: polysaccharide 1 was separated by hot reflux and ethanol precipitation; polysaccharide 2 was obtained through removing protein by Sevag method; polysaccharide 3a was extracted using DEAE-52 fiber column and ultra pure water elution; while polysaccharide 4a and polysaccharide 4b was purified using Sephadex G-100 gel column chromatography through ultra pure water elution. Thus, glucose content of each sample was detected by phenol-sulfuric acid method. Secondly, the purity degrees of the four polysaccharides were tested by gel permeation chromatography (GPC). At last, effects of the various polysaccharide samples on the migration of IEC-6 cells were observed by the cell migration model. As a result, the glucose contents of the four polysaccharide samples (polysaccharide 1, 2, 3a, 4b) were 71.35%, 75.45%, 81.0% and 98.5%, respectively; and the lowest effective doses of cell migration ability were 200, 100, 50 and 30 mg·L-1, respectively. These results indicated that polysaccharide 4b was a sort of homogeneous polysaccharide with the highest glucose level and the optimal pharmacodynamics function through the most critical purification steps. It was concluded that the most critical purification method was efficiency in increasing the content and purity of glucose from SJZD and enhancing the pharmacodynamic activities of polysaccharide. All the results provided evidences for exploring pharmacodynamic materials of SJZD in improving cell migration abilities.

Sijunzi Decoction polysaccharide, separation and purification, IEC-6, cell migration

10.11842/wst.2016.04.008

R289

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-01-06

修回日期：2016-01-14

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81173254）：益气健脾中药对小肠上皮细胞迁移过程多胺信号通路中钙离子调控的研究，负责人：李茹柳；广东省中医药局建设中医药强省科研项目（20151190）：基于多胺信号通路探讨四君子汤多糖促进小肠上皮细胞迁移的作用机理，负责人：蔡佳仲。

＊＊ 通讯作者：李茹柳，博士，教授，主要研究方向：益气健脾中药作用机制及物质基础研究。