基于中医方证代谢组学的生脉散干预老年痴呆症大鼠的药效物质基础研究＊

卢盛文，孔 玲，初 航，韩 莹，韩金伟，刘志东，王喜军

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

基于中医方证代谢组学的生脉散干预老年痴呆症大鼠的药效物质基础研究＊

卢盛文，孔 玲，初 航，韩 莹，韩金伟，刘志东，王喜军＊＊

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

目的：本实验主要利用中医方证代谢组学技术评价生脉散预防老年痴呆的药效及发现其关键物质基础。方法：首先采用灌胃三氯化铝联合腹腔注射D-半乳糖连续90天建立老年痴呆大鼠模型，并利用UPLC-HDMS技术采集和分析模型大鼠尿液代谢数据，共确定了42个老年痴呆症的生物标记物；同时干预组在造模同时采用连续给与生脉散冻干粉溶液（5.3 g·kg-1）对模型大鼠进行治疗。结果：通过Morris水迷宫、脑组织病理学检测及Aβ免疫组化等方法评价了生脉散的干预作用，发现了生脉散具有抑制Aβ毒性、保护神经元和改善认知障碍的作用；在此基础上利用代谢组学技术评价了干预组对42个老年痴呆生物标志物的调节作用，发现生脉散主要影响了色氨酸代谢和脂质代谢的多个靶点；同时采用血清药物化学方法研究了生脉散的体内直接作用物质，找到30种成分并与生脉散明显回调的生物标志物相关联。结论：本实验发现了五味子木质素类及人参皂苷类的多种成分与色氨酸代谢和脂质代谢极度相关，为生脉散预防老年痴呆的药效物质基础。

方证代谢组学 生脉散 老年痴呆症 色氨酸代谢 脂质代谢

老年痴呆症是一种神经退行性疾病，以记忆障碍作为典型症状。目前缺乏有效的治疗药物[1]。中医理论认为老年痴呆症属于“善忘”和“健忘”的范畴，与脏腑功能、气血运行和情志等多种因素有关[2,3]。其治则以调节脏腑功能，运行气血为主。生脉散属补益剂，补肺气养心，《医方论·卷三·清暑之剂》云：“肺主气，心主血，生脉散养心肺之阴，使气血得以荣养一身”。现代临床使用生脉散治疗老年痴呆症也取得了一定的疗效[4-6]。生脉散由人参、麦冬和五味子组成,含有多种活性成分[7-9]。但是这些成分中哪些是有效成分，它们又如何在体内相互配合发挥药效目前尚不清楚。因此生脉散的药效评价及发现药效物质成为了科学阐明生脉散抗老年痴呆机制及新药开发的前提。

生脉散作为方剂具有复杂的成分体系和体内的作用靶点，目前缺乏非导向性的多靶点药物评价方法及药物筛选方法。而中医方证代谢组学的出现有望填补这个领域的空白[10]。该方法通过代谢组学技术系统评价证候的生物学特点，以特征性生物标记物建立中药的药效评价体系。本文通过“证候诊断-方剂效应评价-体内直接作用物质分析”研究思路建立证候与方剂之间的联系[11,12]。根据这种方法本实验在灌胃三氯化铝联合腹腔注射D-半乳糖成功建立老年痴呆症大鼠模型基础上[13]，首先利用代谢组学技术系统评价了老年痴呆症大鼠模型的尿液代谢特点。以老年痴呆特征性的生物标志物建立生脉散的药效评价体系；通过经典的行为学、脑组织病理学检测及Aβ免疫组化等经典方法评价了生脉散的干预作用。在干预有效性的前提下分析了生脉散体内直接作用物质；并且将这些物质与生脉散明显调节的老年痴呆症生物标记物进行相关性分析，发现了生脉散预防老年痴呆症的药效物质基础，为生脉散干预老年痴呆症的作用机理及预防老年痴呆新药开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Morris 水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；Histostar组织包埋机（德国Thermo Fisher Scientific公司）；HM 340E石蜡切片机（德国Thermo公司）；BX 60研究型显微镜（日本OLYMPUS公司）；DP 72显微摄像系统（日本OLYMPUS公司）；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统；995 超低温冰箱（美国Thermo Scientific公司）。美国Waters AcquityTMUPLC液相色谱仪（四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱）；美国Waters SynaptTM G2-Si 质谱分析系统；MassLynx V4.1工作站；Sorvall ST 16R台式离心机（美国Thermo Scientific公司）；KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Nichipet EX微量取样器（100-1 000 μL、10-100 μL，日本NICHIRYO公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；Lab Dancer S25圆周试管振荡器（德国IKA公司）；固相萃取柱SPE（Oasis HLB 3cc 60mg，美国Waters公司）；Thermo Scientific 995 超低温冰箱（美国Thermo Scientific公司）。

1.2 药品与试剂

全须生晒参Panax ginseng C. A. Mey.、麦冬Ophiopogon japonicas（Thunb.） Ker-Gawl.、五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill购于北京同仁堂药店；无水氯化铝（分析级，天津市光复精细化工研究所）；D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司）。

乙腈（色谱级，德国Merck公司）；甲醇（色谱级，美国Fisher公司）；蒸馏水（中国广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲酸（色谱级，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；亮氨酸脑啡肽（美国SIGMA公司）；戊巴比妥钠粉末（上海化学试剂采购供应站）；氯化钠注射液（哈尔滨三联药业有限公司）；实验所用其它试剂均为分析级。

1.3 给药样品的制备

1.3.1 生脉散溶液制备

根据生脉散最早用药量记载：“生脉散：人参，五钱，麦门冬，三钱，五味子，一钱五分，白水煎，温服”（明·汪机《医学原理》），折合现代用药剂量为：人参15.625 g、麦冬9.375 g、五味子4.688 g；根据国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》制定生脉散煎药方法：按照原方剂量称取3种药材放入450 mL蒸馏水中浸泡1 h后，武火将混合液煮沸后调至文火保持微沸1 h，用纱布过滤并收集滤液；滤渣中再加入300 mL蒸馏水重复以上过程2次。将3次的滤液混合放置室温后进行冷冻干燥制备冻干粉。将适量生脉散冻干粉溶于蒸馏水中，配制成生药浓度为0.53 g·mL-1的生脉散灌胃溶液，大鼠灌胃剂量为5.3 g·kg-1。

1.3.2 氯化铝溶液制备

称取氯化铝粉末（AlCl3）0.28 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，充分混匀，配置成2.8 mg·mL-1的氯化铝溶液。

1.3.3 D-半乳糖溶液制备

称取D-半乳糖（D-galactose，D-gal）0.63 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，充分混匀，配置成6.3 mg·mL-1的D-半乳糖溶液。

2 方法

2.1 实验动物及分组

取Wistar大鼠，雄性，9周龄，体质量260±20 g共40只，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，动物许可证号：P00102004。室温饲养，动物自由摄食饮水。适应环境一周后,先将动物进行Morris水迷宫初筛，去除潜伏期小于50 s和游泳姿势不良者，将合格大鼠随机分为空白对照组10只，AD模型组10只，生脉散干预组10只。

2.2 造模方法

大鼠灌胃给予AlCl328 mg·kg-1，同时腹腔注射D-半乳糖63 mg·kg-1，共90天复制老年痴呆症大鼠模型。

2.3 样品采集

AD模型组和干预组于每天下午2∶00复制老年痴呆症大鼠模型，干预组每天上午8∶00按生药量给予生脉散冻干粉溶液5.3 g·kg-1，空白对照组每天给予等量生理盐水；实验开始后，每天夜间将老年痴呆症模型和给药组及空白组大鼠于置于大鼠代谢笼中，次日早8∶00收集夜尿，共计90天。空白对照组、老年痴呆症模型组和生脉散干预组于实验第85天进行持续6天的行为学评价（Morris水迷宫）；于实验第91天采集各组脑组织样本进行免疫组化和HE染色法分析，以及血清样本进行体内成分分析。

2.4 免疫组化和苏木精-伊红染色检测

按照HE染色和免疫组化方法步骤制备海马病理组织切片，并在40和100倍镜下采集照片。

收集得到的尿液样品于-4℃，13 000 rpm离心15 min后取上层清液，蒸馏水稀释一倍，混悬振荡30 s后，0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液2 μL进UPLC-G2-Si。色谱条件：样品分离采用超快速高效液相色谱系统，流动相A为0.1%甲酸乙腈，流动相B为0.1%甲酸水；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.4 mL·min-1；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；梯度洗脱程序见表1。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）：采用SynaptTMG2-Si 质谱分析系统（高分辨四级杆串联飞行时间质谱仪）；脱溶剂气流量：800 L·h-1；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50 L·h-1；离子源温度：110℃；锥孔电压：20 V；毛细管电压：3.0 kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽（Leueine-Enkephalin，正离子模式：[M+H]+=556.277 1，负离子模式：[M-H]-=554.277 1），溶液浓度为1 ng·mL-1，流速为5 μL·min-1；质量扫描范围：m/z 50-1 000 Da，扫描时间0.2 s；以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

表1 代谢组学分析色谱洗脱梯度表

表2 生脉散体内成分分析色谱洗脱梯度表

2.6 血中移行成分数据采集方法

取模型大鼠及药物干预大鼠血清各2 mL，缓慢通过已活化的Waters OASIS固相萃取柱，先用纯净水6 mL洗柱，然后用甲醇6 mL洗脱，收集洗脱液氮气流吹干，残渣以100 μL乙腈定容，混悬震荡60 s，离心（13 000 rpm，4℃，10 min）取上清液供UPLCHDMS分析。

色谱条件：流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5 mL·min-1；进样体积：3 μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析。色谱条件见表2。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）：采用SynaptTM G2-Si 质谱分析系统（高分辨四级杆串联飞行时间质谱仪）；脱溶剂气流量：750 L·h-1；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50 L·h-1；离子源温度：120℃；锥孔电压：30 V；毛细管电压： 2.8 kV（正离子），3.0 kV（负离子）；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1），溶液浓度为1 ng·μL-1，流速为5 μL·min-1；质量扫描范围：m/z 50-1 000 Da，扫描时间0.2 s；以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

2.7 数据处理方法

2.7.1 统计学分析

数据采用SPSS 17.0软件处理，统计结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni检验。P＜0.05认为有显著的统计学差异。

2.7.2 代谢组学分析

本文提出了基于磁开关的近方波脉冲Marx发生器技术路线，摒弃了传统发生器中的气体开关与触发系统，利用磁开关磁场的同步控制，保证各级开关同步导通。同时，基于多倍频电压脉冲的叠加原理，使得发生器具备输出方波脉冲的能力。

将质谱采集到的空白对照组与老年痴呆症模型组大鼠尿液数据标准化处理后进行监督模式的主成分分析（OPLSDA），计算出各个离子的能反映组内聚类和组间分离的贡献度VIP值，同时对标准化后的数据进行t检验，筛选出组间差异P＜0.05的具有统计学意义的离子作为候选离子并进行元素匹配及二级鉴定。

2.7.3 血中移行成分鉴定

将质谱采集到的老年痴呆症模型组和干预组两组血液样本数据通过有监督模式的OPLS-DA分析，对能够引起组间差异的离子进行聚焦。选择平均相对含量在老年痴呆症模型组较低甚至没有，而在干预组中含量较高的离子作为老年痴呆症大鼠模型口服生脉散后的血中移行成分分析的研究对象，再进行二级质谱数据采集，结合网络数据库进行结构鉴定，最终获得入血成分信息。

3 结果

3.1 生脉散对大鼠老年痴呆模型干预作用的行为学评价

在定位航行实验过程中，与空白对照组大鼠相比，老年痴呆症模型组大鼠逃避潜伏期时间显著延长，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与老年痴呆症模型组大鼠相比，生脉散干预组大鼠逃避潜伏期时间显著缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），具体结果见图1A。

图1 生脉散对大鼠老年痴呆症模型干预作用的宏观评价

在空间搜索实验中，与空白对照组大鼠相比，老年痴呆症模型组大鼠穿越平台次数显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与老年痴呆症模型组大鼠相比，生脉散干预组大鼠穿越平台次数显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），具体结果见图1B。

3.2 生脉散对大鼠老年痴呆模型干预作用的病理学评价

脑组织HE染色结果显示（如图1C），模型复制第91天老年痴呆症模型组与空白对照组相比，大鼠的海马CA3区神经元排列松散，数量减少，神经元细胞核逐渐呈现固缩状，胞浆深紫，核膜胞膜界限模糊，可见坏死神经元。干预组与老年痴呆症模型组相比，大鼠脑组织皮层及海马CA3区神经元细胞排列紧密整齐，层次清晰，数量较多，细胞体大而饱满，核仁清楚。

脑组织Aβ1-40免疫组化结果显示（如图1D），模型复制第91天老年痴呆症模型组与空白对照组相比，大鼠脑组织皮层及海马CA3区出现明显的Aβ1-40黄棕色阳性斑块。阳性反应物多聚集在神经元胞体，未见较大的阳性斑块积聚。生脉散干预组与老年痴呆症模型组相比Aβ1-40黄棕色阳性斑块面积明显减少，通过对Aβ1-40蛋白的相对含量进行统计学分析发现，其减少程度具有统计学意义（如图1E）。

3.3 生脉散对大鼠老年痴呆模型代谢轮廓及生物标记物的影响

通过对第90天模型与空白组大鼠尿液数据进行OPLSDA分析（图2A），发现了42个具有显著差异（P＜0.05）的离子并进行鉴定（见表3）。通过分类并按VIP贡献值排布（图2B），将这些差异代谢产物作为反映老年痴呆模型的潜在生物标志物；其次将空白对照组、老年痴呆症模型组与干预组大鼠标准化处理后的尿液数据行非监督型主成分分析（PCA），得到了反映各组大鼠尿液代谢差异变化的Score plot图（图2C），从图中可以看出，老年痴呆症模型组与空白对照组完全分离，同时干预组具有一定的回调趋势。在已鉴定的42个反映老年痴呆模型的潜在生物标志物的基础上研究生脉散的干预作用，通过标志物在各组中的相对含量研究发现生脉散能够回调25个异常代谢产物的水平，其中有2个具有显著性差异，7个具有极显著性差异（图2D）。利用KEGG、HMDB等相关代谢产物数据库将老年痴呆模型的潜在生物标志物建立代谢网络，并以各标志物的VIP值来评价其贡献度（图3A），同时将生脉散能够回调的标志物的VIP值乘以生脉散的相对含量回调率来评价生脉散的干预作用（图3B），发现生脉散对氨基酸代谢、核酸代谢、脂类代谢、多巴胺代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、有机酸代谢都有不同程度的调节作用。通过生脉散干预作用评价发现其最主要影响了色氨酸代谢和脂类代谢。

3.4 生脉散干预大鼠老年痴呆模型的血中移行成分与代谢标记物相关性研究

通过有监督模式的OPLS-DA分析（图4A），得到了平均相对含量在老年痴呆症模型组较低甚至没有，而在干预组中含量较高的离子（图4B），共鉴定30个生脉散血中移行成分。采用PCMS分析方法，分别计算这30个血中移行成分与生脉散能够显著回调的老年痴呆潜在生物标记物效应的Pearson相关系数；本次实验设置0.9≤| r |≤1为极度正（负）相关。生脉散干预组的关联性分析结果如图4C，其中13个血中移行成分与9个尿液代谢产物极度相关。色氨酸代谢和脂质代谢是老年痴呆模型的关键异常代谢网络，生脉散可以明显调节色氨酸异常代谢的3个标志物。其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和当归酰戈米辛H（Angeloylgomisin H）与5-甲氧基色醇成极度负相关；五味子醇甲与3-甲基二氧吲哚成极度正相关；人参皂苷RK3和戈米辛D与顺-4-癸烯酸成极度正相关。

4 讨论

在由于老年痴呆症的疾病机制和生脉散的药物成分都十分复杂，在生脉散预防老年痴呆发生发展机制的研究中，常规的药物活性成分筛选和作用机制研究方法多为多成分-单指标、单成分-单指标或单成分-多指标的研究模式。即使有多成分-多指标的研究过程，一般也是预先限定的多个目标成分或指定的检测指标。这种非开放式的研究模式在早期探索阶段意义重大，但是随着药物分析技术的不断进步，人们需要利用这些新技术开发新的研究方法，更客观、真实、全面地研究生脉散预防老年痴呆的多成分作用机制。因此本次实验在利用经典的行为学和病理学验证了生脉散干预老年痴呆作用的背景下，采用方证代谢组学研究模式深入研究生脉散多成分的作用机制。首先通过代谢组学技术开放式寻找机体的评价指标，客观分析了老年痴呆模型组大鼠的尿液异常代谢产物，以此来评价生脉散的多靶点调节作用。发现生脉散对老年痴呆模型大鼠的42个生物标记物有不同程度的调节作用，其中色氨酸及脂质代谢异常具有明显的调节作用。从代谢组学角度阐明了生脉散的多靶点作用机理；同时利用血清药物化学技术分析了生脉散的体内入血成分，并将这些入血成分与生脉散明显回调的生物标记物进行了相关性分析，发现五味子木质素类成分和人参皂苷类成分与色氨酸代谢和脂质代谢异常极度相关，其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和当归酰戈米辛H与5-甲氧基色醇成极度负相关；五味子醇甲与3-甲基二氧吲哚成极度正相关；人参皂苷RK3和戈米辛D与顺-4-癸烯酸成极度正相关。这些相关性成分将作为生脉散干预老年痴呆的药效物质基础进行进一步验证研究。

图2 生脉散对大鼠老年痴呆症尿液潜在代谢标记物的干预作用研究

图3 生脉散干预老年痴呆尿液潜在生物标记物代谢网络影响评价图

表3 老年痴呆模型大鼠尿液潜在生物标记物的具体信息表

综上所述，本次实验首先宏观评价了生脉散对老年痴呆大鼠模型干预作用。在明确药效作用背景下，采用方证代谢组学技术，以老年痴呆症的生物标记物为基础，建立生脉散抗老年痴呆生物药效评价体系对生脉散进行抗老年痴呆的多靶点评价。同时与生脉散的体内入血成分相关联，发现了生脉散干预老年痴呆的药效物质基础。为中药方剂生脉散的预防老年痴呆药效评价，以及中药成分抗老年痴呆新药开发奠定基础。

图4 生脉散的入血成分与大鼠老年痴呆症尿液潜在代谢标志物的相关性研究

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A Research for Evaluating the Effectiveness and Discovering the Pharmacodynamic Substances of Sheng Mai San (SMS) in the Treatment of Alzheimer’s Disease (AD)

Lu Shengwen, Kong Lin, Chu Hang, Han Ying, Han Jinwei, Liu Zhidong, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The aim of this study was to evaluate the effectiveness and discover the pharmacodynamic substances of SMS in the treatment of AD. AD model rats were successfully established with the 90-day continuous intragastric administration of aluminium chloride and intraperitoneal injection of D-galactose. Morris water maze test, histopathological staining and immunohistochemical staining were adopted to evaluate the progress of AD in model rats and the efficacy of SMS. Metabolomic technology platform was used to reveal the potential biomarkers and the metabolic network of AD and the target spots of impacted metabolic pathways after the administration of SMS. As a result, it was found that SMS performed the regulatory effects on certain metabolic pathways, in which tryptophan and lipid metabolism were involved in the main metabolic pathways influenced by SMS. Serum pharmacochemical technologies of TCM were introduced to investigate the constituents absorbed into the blood after lavage administration of SMS. In conclusion, the constituents were associated with target spots of influenced metabolic pathways which elucidated the pharmacodynamic basis. The components of lignins and their metabolites and ginsenoside were the most relevant materials of AD associated with tryptophan and lipid metabolism, which may be the pharmacodynamic basis of AD playing therapeutic roles of SMS.

Chinmedomics, Sheng Mai San, Alzheimer's disease, tryptophan metabolism, lipid metabolism

10.11842/wst.2016.10.011

R285

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-19

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81430093）：中药体内药效物质基础的系统分析方法学——中医方证代谢组学研究，负责人：王喜军；科学技术部“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09101043-011）：中药经典名方整合作用机制关键技术研究，负责人：王喜军。

＊＊ 通讯作者：王喜军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中药血清药物化学及中医方证代谢组学研究。