西瑞香素对肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的影响

姜洪芳，白　雪，牛慧彦，何　平

中国医科大学附属盛京医院老年病科，沈阳 110004



·论著·

西瑞香素对肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的影响

姜洪芳，白雪，牛慧彦，何平*

中国医科大学附属盛京医院老年病科，沈阳 110004

[摘要]目的探讨西瑞香素对肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的影响。方法通过Transwell小室分析西瑞香素对肺癌A549细胞侵袭能力的影响；划痕实验检测西瑞香素对肺癌A549细胞迁移能力的影响；Western blotting检测西瑞香素作用于A549细胞后MMP-2、MMP-9侵袭相关蛋白的表达。结果Transwell小室实验结果提示，西瑞香素对A549细胞侵袭能力有抑制作用；划痕实验结果提示，西瑞香素对A549细胞迁移能力有抑制作用；Western blotting结果提示，西瑞香素抑制MMP-2、MMP-9侵袭相关蛋白的表达。随着药物浓度增加，MMP-2、MMP-9表达减少，具有剂量依赖性。结论西瑞香素对A549细胞体外侵袭及迁移有抑制作用，这种作用与抑制MMP-2、MMP-9表达有关。

[关键词]西瑞香素;肺癌A549细胞;侵袭；迁移

0引言

肿瘤的侵袭转移能力是恶性肿瘤的一个基本特征，临床中许多肿瘤患者的根本死因并非是肿瘤原发病灶，而是由于肿瘤晚期的侵袭和转移引起的。肿瘤的侵袭和转移是当前肿瘤治疗的一大难题。非小细胞肺癌发病率高，转移早，大量国内外研究均证实，导致肺癌患者最终死亡的首要原因是肺癌的侵袭性转移[1]，这也是当今肺癌治疗的重点和难点。

西瑞香素(Daphnoretin)是一种天然香豆素，是从瑞香科植物南岭荛花中提取出来的有效药物成分[2]。近年来国内外与之相关的药理研究获得了很大进展，目前已有研究显示,西瑞香素具有抗真菌[3]、抑制DNA合成[4]、激活蛋白激酶C[5-6]、抗乙型肝炎病毒[7]和呼吸道合胞体病毒(RSV)[8]等生物学活性。最近的研究发现，西瑞香素在抗肿瘤方面同样具有显著作用。有实验显示，西瑞香素对白血病[9]、宫颈癌[10]、骨肉瘤细胞[11]有明显的生长抑制和促进凋亡的作用，而我们的前期实验[12]已经证实，西瑞香素可以抑制人肺腺癌A549细胞系增殖，其机制也可能和抑制增殖、诱导其凋亡有关。西瑞香素高效低毒的特点使其成为潜在的理想的抗肿瘤药物。然而，西瑞香素在人类肺腺癌细胞中对侵袭迁移的影响仍不清楚。

本研究应用Transwell小室实验、划痕实验检测西瑞香素对A549细胞株的体外侵袭和迁移能力的影响，同时检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达，探讨西瑞香素影响A549细胞株侵袭和迁移能力的机制。

1实验材料与方法

1.1实验试剂人肺癌A549细胞来自中国医科大学细胞生物教研室，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。西瑞香素(分子量352.29，购于中国药品生物制品检定所)20 mg加入568 μL DMSO配制成100 mmol/L母液，过滤分装，-20 ℃保存备用，工作液浓度按实验需要临用前配制。Transwell小室(Corning Costar Transwell细胞培养小室，美国，8 μm孔径)，Matrigel胶购于美国BD公司，MMP-2及MMP-9抗体购于美国 Santa Cruz 公司。倒置显微镜、稳压稳流型电泳仪、电泳槽、成像分析照相系统均为我院中心实验室提供。

1.2细胞培养人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，待细胞长满培养瓶瓶底(一般2～3 d)后，调整细胞浓度为5×105/mL，无菌条件下用0.25%的胰酶消化传代。

1.3Transwell小室侵袭实验Matrigel 胶50 μL包被 Transwell 小室上层，将小室置于24孔板内，37 ℃放置3 h，超净台内风干 4 h。微孔滤膜用PBS在37 ℃平衡2 h备用。取对数生长期A549细胞以无血清培养基洗涤重悬，调整细胞密度为5×105/mL，取 200 μL 悬液加入 Transwell 小室的上室，处理组分别加入用无血清培养基稀释的不同浓度的西瑞香素50 μL，使终浓度分别为 10、20 μmol/L，对照组加入不含药物的细胞悬液50 μL。在下层小室加入 500 μL 20%血清浓度1640培养液作为趋化。细胞于37 ℃、5%CO2温箱中孵育 24 h。取出 Transwell 小室，PBS 淋洗，用酒精棉擦去微孔膜上层的Matrigel 凝胶和未穿膜的细胞。固定、吉姆萨染色后，在倒置显微镜下随机选择5个视野，高倍镜下分别计数5个视野的移至微孔膜下层的细胞。穿膜细胞数与对照组穿膜细胞数相比作为评价肿瘤细胞侵袭能力强弱的指标。

1.4划痕实验体外培养人肺癌A549细胞，以1×105/mL的浓度接种于6孔板，每孔接种1 mL。待细胞90%融合以后，用微量移液器Tip(规格为200 μL)对细胞进行划痕损伤，每孔划痕1次，宽度和长度控制在1 mm×10 mm左右。用无血清培养基轻轻吹打划痕附近，吸去培养基，反复3次，尽量将刮掉的细胞冲洗干净。处理组分别加入用无血清培养基稀释的不同浓度的西瑞香素2 mL，使终浓度分别为 10、20 μmol/L，对照组加入不含药物的细胞悬液2 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养。在培养0、24 h将6孔培养板放在倒置显微镜下(10×10倍)观察划痕周围细胞向损伤区的迁移情况，照相并测量划痕区汇合度，进行统计分析。

1.5Western blotting检测MMP-2、MMP-9相关蛋白表达对数生长期A549细胞接种于75 cm2培养瓶中过夜，并加入终浓度为0、10、20 μmol/L的西瑞香素溶液，采用加等量RPMI-1640培养基作为阴性对照，置5%CO2的饱和湿度37 ℃温箱中培养24 h后，冰上裂解30 min，提取总蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳，其中一抗MMP-2、MMP-9、GAPDH 1∶200稀释，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶结合的相应二抗，常温2 h，TBST漂洗PVDF膜3次。参照碧云天公司ECL试剂盒说明书，进行显色反应。曝光1～8 min，一次性完成定影、显形、图像分析系统测定条带的光密度值。

2实验结果

2.1西瑞香素对A549细胞体外侵袭能力的影响应用Transwell小室检测西瑞香素对肺癌A549细胞侵袭能力的影响,见图1、图2。

由图1、图2可见，加入Matrigel 胶后，发现西瑞香素处理后实验组细胞的侵袭能力明显降低，穿过Transwell小室膜的细胞随药物浓度的增加逐渐减少。

图1　西瑞香素对A549细胞体外侵袭能力的影响(200×)

图2　西瑞香素对A549细胞体外侵袭能力的影响

2.2西瑞香素对A549细胞体外迁移能力的影响应用划痕实验检测西瑞香素对肺癌A549细胞迁移能力的影响，发现西瑞香素处理后，实验组细胞的迁移能力降低，细胞汇合度相比对照组随药物浓度的增加逐渐减小。见图3、图4。

2.3西瑞香素对A549细胞MMP-2 及MMP-9 蛋白表达的影响采用Western blotting方法检测西瑞香素对A549细胞侵袭相关蛋白的影响。随药物浓度增加，MMP-2、MMP-9表达减少。见图5。

图3　西瑞香素对A549细胞体外迁移能力的影响(100×)

图4　西瑞香素对A549细胞体外迁移能力的影响

3讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，肿瘤的恶性程度越高，其发生侵袭转移的可能越大。肿瘤细胞的侵袭、转移是一个十分复杂的动态的连续的生物学过程，由多个相对独立的步骤组成。首先肿瘤细胞分泌蛋白降解酶类降解细胞外基质成分，形成肿瘤细胞迁移通道，同时肿瘤细胞运动性增强，穿透细胞外基质及血管基底膜进入循环，逃避免疫系统识别与破坏，到达继发部位后，在新生血管形成的前提下增殖并形成转移灶[13]。因此,肺癌细胞能否突破细胞外基质是肺癌细胞局部浸润和远处转移的关键。

图5　西瑞香素对MMP-2 及MMP-9 蛋白表达的影响

细胞外基质及基底膜的网状物包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白。人工构建基底膜材料Matrigel是从EHS小鼠肉瘤中提取的，其主要成分：层粘连蛋白，Ⅳ型胶原蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白，纤维原蛋白生长因子，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂和其他生长因子。细胞侵袭实验利用Matrigel胶模拟细胞外基质，形成肿瘤侵袭和转移的天然屏障。肿瘤从原位增殖到浸润转移的演进过程中，必须具备降解细胞外基质的能力。侵袭实验发现，西瑞香素处理后，实验组细胞的侵袭能力明显降低，穿过Transwell小室膜的细胞随药物浓度的增加逐渐减少。

肿瘤细胞降解基底膜结束，游离细胞向周围游走迁移是肿瘤转移过程的另一个重要环节，我们使用细胞划痕实验模拟这一环节。细胞划痕实验是一种操作简单、经济实惠的研究肿瘤细胞迁移能力的体外试验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。肿瘤细胞的侵袭转移能力与其运动能力密切相关。划痕实验从形态学方面反映了西瑞香素对A549 细胞运动能力的抑制效果，跨过划痕的细胞数与对照组相比明显减少。

基质金属蛋白酶在肿瘤侵袭和转移方面起到重要作用，它通过降解细胞外基质，促进肿瘤扩散。抑制MMP活性是肺癌治疗的又一新靶点，其中MMP-2和MMP-9是降解Ⅳ型胶原最主要的蛋白酶，在肿瘤血管形成、肿瘤细胞的侵袭及转移灶的形成中起重要作用[14]。目前，大量国内外实验研究结果均证实，MMP-2、MMP-9 与肺癌的发生、发展、浸润、转移和预后密切相关[15-17]。Suzuki 等[18]运用免疫组织化学法检测 MMP-2 和 MMP-9 在非小细胞肺癌中的表达，结果提示，两者在非小细胞肺癌中均有高表达。Peng 等[19]分析研究了17篇论文的2 029例非小细胞肺癌，结果表明，MMP-2、MMP-9过高表达和非小细胞肺癌患者的转归及预后不良相关。薛洋等[20]应用 ELISA 的方法检测了 19 例肺部良性病变及108 例非小细胞肺癌组织中的MMP-2、MMP-9蛋白表达水平。结果发现，非小细胞肺癌组织中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平高于癌旁肺组织和肺良性病变组织，同时伴有淋巴结和(或)远外转移的肺癌中MMP-2、MMP-9的表达水平高于不伴有淋巴结和(或)远外转移的肺癌。从而推测非小细胞肺癌组织中MMP-2、MMP-9的表达水平可显著升高，而且与非小细胞肺癌的病情进展和转移密切相关。本研究结果提示，西瑞香素可以抑制A549细胞MMP-2和MMP-9的表达，且呈剂量依赖性。

综上所述，西瑞香素对A549细胞体外侵袭及迁移有抑制作用，这种作用与可能与抑制MMP-2、MMP-9表达有关，这为西瑞香素成为潜在的治疗肺癌的理想药物提供进一步的理论依据。

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Effects of daphnoretin on invasion and migration of A549 lung cancer cellsJIANG Hong-fang，BAI Xue，NIU Hui-yan，HE Ping*( Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of daphnoretin on the proliferation and invasion of A549 lung cancer cells.MethodsThe effects of daphnoretin on the invasion of lung cancer A549 cells was detected by transwell assays and the effects of daphnoretin on the metastasis of lung cancer A549 cells was detected by Wound Healing.The expression of MMP-2，MMP-9 was evaluated by Western blotting on A549 with daphnoretin.ResultsDaphnoretin was effective in inhibiting the invasion and migration of A549 cells.Western blotting analysis revealed that daphnoretin decreased the protein levels of MMP-2,MMP-9 in a dose-dependent manner.ConclusionDaphnoretin inhibited the invasion and metastasis of lung cancer cell line A549 by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

Key words：Daphnoretin;A549 human lung cancer cells;Invasion;Migration

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602001

*通信作者

收稿日期：2015-10-15