抗菌肽及其分子改造研究进展

刘明辉， 张尚志， 马 艳， 费冬琼， 徐家萍

(1.安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036)



抗菌肽及其分子改造研究进展

刘明辉1， 张尚志2， 马 艳2， 费冬琼2， 徐家萍2

(1.安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036)

摘要抗菌肽是一种参与生物体抵抗外界病原体侵染的功能性多肽，从低等细菌到高等动物广泛存在，且表现出较广的抗菌谱，对抗菌肽的功能及相关分子改造进行综述，并展望了其在农业和医药领域的应用前景。

关键词抗菌肽；功能；分子改造

抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)是指在细菌、植物、昆虫以及脊椎动物机体内产生的一种可以抵抗外界病原菌侵染的活性多肽。1980年研究者在大肠杆菌(Escherichia coli)中发现了具有抗菌作用的活性物质并命名为Cecropins，后来逐渐在植物和脊椎动物中也发现该活性物质的存在[1-2]。由于AMPs具有分子量小、热稳定性好以及易溶于水等特性，是生物体抵御外界病原物侵染的重要物质之一。抗生素是目前使用最为广泛的抗菌药物，但病菌的抗药性会随着抗生素的使用而逐渐增强。因此，研发出既具有抗菌效果又不会产生抗药性的药物成为目前研究的热点。近年来，基于AMPs所具备的特殊性质很快受到科学家的青睐，利用分子生物学手段，对AMPs的基因进行优化重组并转化到特定原核生物或真核生物体内进行表达，从而制备出可以抵御病原细菌侵染的转基因菌株或品系。随着研究的不断深入，抗生素将可能被AMPs所取代，使之成为抗菌类药物的最佳选择之一。

虽然AMPs具备天然的优良特性，但也存在一定的缺点，如天然AMPs本身的抗菌活性较低，无法完全抵抗病原菌的侵染；另外，一部分AMPs对细胞表现出溶血现象，不能直接用来协助生物抵抗外界病原菌。因此，获得更加高效无毒的AMPs成为近年来的研究热点。目前主要是以其物理和化学性质为基础，从分子水平上对其基因进行改造来开发出高效无毒的AMPs。笔者对AMPs的研究现状进行总结，并展望今后可能的研究方向。

1抗菌肽种类及其特性

1.1抗菌肽的种类随着生物信息学技术的不断完善，AMPs数据库已经被建立(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。AMPs的抗菌谱包括细菌、古生菌、原生生物、真菌、植物和动物，其中主要参与动物的抗菌作用。数据库中总共包含2 665种AMPs，这些AMPs具备多种活性，如抑制细菌、真菌、病毒、肿瘤、原生动物等以及抗杀虫剂、抗氧化、抑制蛋白酶和伤口愈合等功能[3]。

1.2抗细菌活性AMPs对细菌抑菌活性表现比较明显，主要是Gram-positive bacterium和Gram-negative bacterium，可以快速高效特异地消灭靶标，且大部分AMPs都是天然的。王洪法等[4]至今已发现了至少有113种以上病原菌受AMPs的抑制和杀灭。韩冬等[5]、程延才[6]对4类约20种家蚕AMPs(Cecropins、Moricins、Gloverins和Attacins)进行原核表达或真核表达，采用平板打孔抑菌法(琼脂平板打孔扩散检测法)和最小抑菌浓度法(MIC)检测AMPs对10种供试菌的抑菌效果，结果表明，大部分AMPs对供试菌株均表现出较强的抗菌活性。杨莹等[7]利用以重叠PCR方法人工合成的家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophila melanogaster)Cecropin B(CecB2)基因分别进行原核表达，抗菌试验结果表明，融合的BmCecB2和DmCecB2对E.coli(DH5α)均具有不同程度的抑制作用。虽然原核表达后得到的AMPs具有抑菌能力，但抑菌效果不明显。Li等[8]利用真核杆状病毒表达系统(BmNPV/Bac-to-Bacexpressionsystem)对家蚕CecropinB进行表达，发现其对大肠杆菌具有明显的抑制作用。因此，真核表达系统更适用于大量表达及纯化AMPs，推测可能是由于原核表达缺乏翻译后修饰能力。

1.3抗真菌活性部分AMPs对真菌有一定的活性。最早是在蛙皮肤的蛙皮素(Magainins)中发现的，不仅对Gram-positive bacterium和Gram-negative bacterium能够起作用，而且对真菌具有较强的杀伤作用。Brown等[9]在蜡蛾(Galleria mellonella)中发现了4种AMPs，这4种AMPs对丝状真菌的抗性最强，对酵母也具有一定的抗性。在人中性粒细胞中发现的AMPs-1、AMPs-2则具有抗新型隐球菌和白念珠菌活性[10]。在苏格兰松树幼苗发现的植物防御素家族抗真菌肽PsDef1、Fusarium oxysporum、Bortrytis cinerea、Candida albicans等对真菌均有抗菌活性[11]。

1.4抗病毒活性从20世纪80年代开始，抗菌肽对病毒的杀伤现象逐渐被发现，其抗病毒机理并非是直接抑制病毒DNA的复制或基因表达，而是对病毒被膜间接起作用从而达到抑制的目的。钟文彪等[12]将两性AMPs类物质注射到家蚕体内，结果表明，注射AMPs的家蚕发病指数显著降低，说明AMPs能够起到抑制家蚕病毒病的发生。Chattopadhyay等[13]在海龟蛋中发现一种含有36个氨基酸的阳离子蛋白，结果证实是AMPs的TEWP，其三级结构与脊椎动物β防御素有较高的同源性，能够抑制envelopedrhabdovirus和Chandipuravirus的侵染。人类AMPs的α-HNP(HNP-1，HNP-2，HNP-3 和HD-5)、β-HNP、θ-HNP、LL-37和Cathelicidins等均具有一定的抗病毒活性[14-20]。

1.5抗原虫活性天蚕素及其合成类似物在体外对原生动物表现出一定的杀灭作用，主要包括可以引起trypanosomosis和malaria2种寄生虫。徐进署等[21]研究结果表明，Cecropins是一种活性较高的多肽类物质，对寄生虫等原生动物表现出较高的杀伤活性，如Leishmania等。

1.6抗癌活性AMPs除能够抑制细菌、真菌、病毒等外，也对肿瘤细胞具有一定的抑制作用。Baker等[22]研究发现，Magainin2对许多肿瘤细胞具有一定的抑制作用，如lungcancer、breastcancer、lymphoma、melanoma等。Moore等[23]研究发现，具有抗多种肿瘤细胞活性的阳离子的Cecropins对能够抵抗多种药物的肿瘤细胞也有一定的抑制作用。王芳等[24]利用单细胞凝胶电泳法(singecellgelexlectrophoresis，SCGE)观察AMPs的CM4组分对白血病K562脊髓细胞和对照组核染色质的DNA影响，结果发现，AMPs的CM4对正常白细胞未表现出任何异常，而对K562细胞的核染色质DNA表现出明显的断裂作用。

1.7免疫调节作用作为人体免疫系统组成部分之一的AMPs，除可以抵抗外界病原菌的侵染，还可以作为免疫调节分子参与免疫调节，如影响细胞因子释放到细胞内，细胞的化学趋向性，促进血管更新、损伤愈合以及炎症恢复[25-26]。

2抗菌肽分子改造

由于天然AMPs的多功能性，其应用价值非常大。但天然AMPs本身抗菌活性低，部分AMPs对真核生物具有一定的溶血现象，直接将天然AMPs应用于实践存在潜在的风险，因此，需要对AMPs进行适当的改造使其更加适合于实际应用。目前，改造AMPs主要遵循提高AMPs的抗菌活性和降低毒性两大目标。改造手段主要包括杂合肽、残基取代和截断以及与功能蛋白杂合。同时，以AMPs的抗菌谱、抗菌活力以及溶血性和多种生物化学标准为标准，主要包括序列长度、氨基酸构成、静电荷、a螺旋倾向性、疏水性、疏水与亲水角度和自身联系能力(如聚集能力)、由氨基酸侧链决定的两亲性等[27]。

2.1残基的取代、截断和加长Temporin-SHf是目前发现的最短的天然AMPs，仅含有8个氨基酸，且富含苯丙氨酸，具有抗菌谱较广的特性，如对Gram-negative/ positive bacterium、酵母等都有良好的抗性，且不存在溶血现象[28]。Mangoni等[29]发现了存在于欧洲红蛙(Rana temporaria)中由13个氨基酸组成的一种AMPs，该AMPs表现出较强的抗Leishmania活性，且对人体红细胞并不表现出溶血现象。这表明这些分子量小的AMPs也具有与普通AMPs一样的功能，且这种AMPs在实际中更容易通过合成的方法获得，有利于实际的研究与生产。目前比较通用的方法是在不影响其正常功能的前提下对常见的AMPs进行截断，从而获得小分子量的AMPs。如对含有半胱氨酸残基的植物AMPs的thionin进行多部分截断后得到一条与亲本AMPs活性相同的小分子AMPs，其对多种病原菌均表现出良好的抗性[30]。作为人体免疫系统中不可缺少的组成成分之一的defensins是一种由3对6个二硫键阳离子组成的AMPs。首先截断其C端的10个氨基酸后，再用8种不同的氨基酸残基对其第5和6个氨基酸残基依次进行替换，结果表明，W2、V2均表现出较亲本对Gram-negative bacterium较强的抗性，特别是Y2替换型，且基本无溶血现象[31]。

另外，残基取代也是一种较好的改造方法，通常是AMPs上固定的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基所替换。虽然AMPs的Pandinin2在较低浓度下即可杀灭Gram-negative bacterium和Gram-positive bacterium，但同时也表现出明显的溶血现象，实际应用效果较差。为了提高其实际应用，Rodriguez等[32]分别用V、GV、VG、GVG对第14个位置的脯氨酸进行替代，结果表明，利用GVG取代后的AMPs不仅具有与亲本相同的活性且大大降低了其溶血现象，增加了实际应用治疗的可能性。另外，对残基的对映体进行替换也是一种特异高效的方法。PaPo等[33]以含有12个氨基酸的AMPsK5L7为模板合成了位于第三、第四、第八、第十位亮氨酸的4种对映体4D-K5L7，抑菌试验发现仅Gram-negative bacterium不受K5L7AMPs的抑制。

AMPs的溶血作用与抗菌活性和两亲性成反比。通过简单的物理方法来获得活性强且毒性低的AMPs可能性较低，常用的办法是通过分子生物学方法。Kondejewski等[34]通过对映体替换的方法对AMPs的gramicidinS14的14个氨基酸残基依次进行替换，结果表明，其中一个改造产物可以使其溶血现象降低约130倍，且抗菌能力也较大程度上得到加强。AMPs改造除能增加抗菌活性和减小细胞毒性外，在应用于临床时还要注意防止被体内水解酶降解。通常情况下，只要对AMPs序列上水解酶酶切位点进行替换即可达到使其不能被水解酶降解的作用，或采用酰胺化和乙酰化的方法改变其末端，改造后的AMPs表现出较强的抗水解酶水解的现象，但抑菌试验结果表明，其抗菌活性大大降低。因此，后期主要集中在研究出抗菌活性不变且能够不被水解酶水解的AMPs。Stromstedt等[35]对AMPsLL37衍生的EFK17上水解酶酶切位点采用色氨酸替换来研究其对水解酶的稳定性，结果表明，EFK17基本未受水解酶的影响，且抗菌活性试验结果表明其抗菌活性也未被消弱。

残基加长也是一种能够改造AMPs使其活性大大提高的方法。Lockwood等[36]将十二烷基和十八烷基脂肪酸连接到AMPsSC4的N端上，抑菌试验结果表明这些脂肽对炭疽杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌和革兰阳性菌的杀菌效果均增加了30多倍。Schmidtchen等[37]将一段疏水性寡肽延伸连接到AMPs的末端并发现也能增强其抗菌活性。

2.2杂合肽目前杂合肽是AMPs分子改造中应用最广泛的方法之一，即将2种不同AMPs的部分序列通过重组的方法重新组合后形成一个新的杂合AMPs。Tian等[38]利用计算机根据两亲性阳离子AMPs的HP(2-20)、LFB15 (W4，10)和cecropinA结构和功能上的关系设计出4种不同的杂合肽，并生物合成2种成功率较高的AMPs。抗菌试验结果表明，AMPs的LH28抗菌活性显著增加，且基本未出现溶血现象。Wang等[39]将Attacin和Thanatin融合，在E.coli中表达纯化后得到一种新的杂合肽Attacin-Thanatin，抑菌试验结果显示，杂合肽对选择的几种Gram-negative bacterium和Gram-positive bacterium都表现出较好的抑制作用，且基本上对红细胞未表现出溶血现象。根据APD2数据库，在CecropinA和Melittin基础上设计的2种新型AMPsCA(1-7)-M(4-11) (CAM) 和CB(1-7)-M(4-11) (CBM)，顺利地在毕赤酵母表达系统中表达并得到纯化，抑菌试验结果表明，这2种杂合肽对Klebsiella pneumoniae、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa以及Salmonella等都表现出较好的抗菌能力，且无溶血现象，具备临床应用的基础[40]。

He等[41]根据AMPs的理化性质并参考抗变形StreptococcusAMPs之后，建立3个随机的多肽库：a-helix库、RW库(以arginine和tryptophan为基础)和binary库(以疏水性/芳香族氨基酸FKKFWKWFRRF为基础)，其中，每一个多肽的大小和结构框架且疏水性氨基酸/芳香族氨基酸比例、两亲性、a螺旋形、和静正电荷都存在差异。3个多肽库中，间接或直接组合2个多肽库后筛选得到几种得分较高的抗变形链球菌AMPs。

王成林等[42]依据E.coli基因密码子的偏爱性，采用重叠延伸PCR的方法扩增出经过适当优化的Thanatin基因，经重组后得到与家蚕核型多角体病毒多角体Polyhedrin基因融合的重组基因并对其进行表达，在盐酸羟胺切割后纯化的融合蛋白表现出一定的抑制细菌活性的AMPs。

2.3与功能蛋白杂合改造与功能蛋白氨基酸杂交也是一种较好的AMPs改造方式。Li等[43]将人类β-防御素分别与甘露糖、凝集素、溶菌酶进行连接。在体外通过分子生物学手段将两者连接起来，体外抑菌试验结果表明，融合肽对抗青霉素的Staphylococcus aureus表现出较强的抑菌活性，且融合肽的抗菌活力比其亲本更强，实际应用表明，融合肽对血管更新和组织愈合表现出良好的效果。这种与免疫调节因子融合来改造AMPs的方法不仅能够提高AMPs的抗菌能力，而且还能够提高在临床应用中的可行性，这将是后期改造的一种良好的选择方式。特异性靶向AMPs(specificallytargetedantimicrobialpeptide，STAMP)就是将AMPs与特异性的靶向蛋白或抗体结合，此种组合方式可使AMPs发挥出最大的特异性，且对正常的细胞核和良性细菌无副作用或副作用较小[44]。Eckert等[45]将STAMP特异地定位到变异streptococcusCSPC端的16 个氨基酸序列(CSPc16)，AMPs的novispirinG10 的衍生物G2作为AMPs区域，利用化学合成法成功构建了STAMP-C16G2，该杂合AMPs可以高效特异性地杀灭生物膜中变异的Streptococcus。Eckert等[45]研究发现，经C16G2 处理一段时间后浮游状态细菌的死亡率比G2处理的高很多倍，但对口腔Streptococcus基本无影响。因此，将CSPc16 的KH连接到G2 上可以明显提高STAMP特异地杀灭变异的Streptococcus，但不会对其他细菌产生任何副作用。He等[46]选择了许多针对变异链球菌的AMPs、连接体区域以及靶向定位区域，用随机组合的方式进行杂合AMPs的构建，结果筛选得到一个新的STAMP并具有很好的抗菌活性。为了减少溶血作用且保留其抗肿瘤作用，将AMPs与肿瘤特异性抗体杂合构建出杂合AMPs，此种方法大大提高了AMPs在实际临床中的应用。

虽然通过杂合的方法可以明显地改造AMPs的治疗效果，但其稳定性方面没有相关的阐述。Xi等[47]基于LH28和菌丝霉素构建了一种新的杂合抗菌肽LHP7，其抗菌效果不仅高于其亲本，而且其抗菌谱、pH稳定性、热稳定性以及溶血性均得到有效提升，另外还具有抗胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解的性质。Shin等[48]以Papiliocin和Magainin2为亲本成功构建了杂合PapMA-k，其抗菌能力不仅得到了有效提高，还表现出抗细菌的选择性和抗炎症的作用。

3讨论

目前，抗生素的广泛使用所带来的副作用、耐药性和残留等问题已成为世界性难题。长期使用抗生素等抗菌药物使得病原菌的耐药性越来越高，给人类健康造成巨大的潜在威胁，因此，研发出具有抗病原菌侵染且可应用于临床的新型抗菌制剂越来越重要。AMPs具备分子量小、高温不易降解和无相应的抗原性等特性，使其可能会替代抗生素成为新一代的抗菌药剂。AMPs除可以直接消灭病原微生物外，也可以参与免疫调节从而达到抵抗外界病原菌的侵染。随着研究的深入，天然AMPs的缺点也逐渐被发现，如溶血现象，由于这些缺点使得AMPs在实际应用中受到巨大阻碍。目前，在不改变AMPs本身抗菌特性的基础上，研究出活性高、无溶血性以及不易水解的AMPs成为后期研究的重中之重。目前应用较广泛的改造方法较多，如AMPs的残基取代、截断和加长、杂合肽以及与功能蛋白杂合等，且这些方法都已取得了非常明显的成果，特别是特异性靶向AMPs这一改造方法大大加快了AMPs在实际临床上的应用，这也将是AMPs研究的一个重要方向。

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基金项目安徽省农科院种子工程项目(16D0608)。

作者简介刘明辉(1967- )，男，安徽合肥人，副研究员，从事家蚕育种及免疫研究。

收稿日期2016-04-08

中图分类号S 816.7

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)16-147-04

ResearchProgressofAntimicrobialPeptidesandItsMolecularModification

LIUMing-hui1，ZHANGShang-zhi2，MAYan2etal

(1.InstituteofSericulture，AnhuiAcademyofAgriculturalSciences，Hefei，Anhui230061; 2.SchoolofLifeSciences，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei，Anhui230036)

AbstractAntimicrobial peptides (AMPs) is a functional peptides involved in organism response against pathogenic infection.The AMPs is produced in many organisms from bacteria to human，and shows a potent，broad spectrum antibiotics against microorganisms.In this research，we reviewed the function of antimicrobial peptide and relevant molecular modification，and forecasted the application prospect in agriculture and medical fields.

Key wordsAntimicrobial peptides; Function;Molecular modification