连翘体外、体内抗甲型流感病毒的实验研究*

潘曌曌，王雪峰

辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032

连翘体外、体内抗甲型流感病毒的实验研究*

潘曌曌，王雪峰

辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032

目的：观察连翘体外、体内抗甲型流感病毒的作用。方法：采用血凝实验方法，将不同浓度流感病毒接种鸡胚尿囊腔制造甲型流感病毒感染鸡胚模型，观察不同浓度连翘提取物对造模后鸡胚的预防和治疗作用。采用鼻腔接种甲型流感病毒FM1株诱导幼龄昆明种小鼠肺炎，将不同浓度连翘提取物以灌胃给药途径治疗小鼠流感病毒性肺炎，观察各组小鼠一般状态、肺指数、肺组织形态学及对IV RNA表达的影响。结果：中药连翘可预防流感病毒在鸡胚内增殖，其预防作用随药物浓度降低而减弱，但各浓度之间差异无统计学意义（P＞0.05）。中药连翘对感染IV鸡胚具有治疗作用，其治疗作用随浓度降低而减弱，但各浓度间差异无统计学意义（P＞0.05）。中药连翘可改善流感病毒肺炎小鼠一般状态，可减轻流感病毒肺炎小鼠肺组织病变，并抑制流感病毒在小鼠肺组织中复制。结论：中药连翘提取物具有体外抗流感病毒作用及对流感病毒肺炎小鼠的治疗作用。

连翘；甲型流感病毒；鸡胚；流感病毒性肺炎

病毒性肺炎是严重危害儿童健康的常见疾病，其中流感病毒是主要病源之一。流感传播迅速，短时间内可造成局部地区的爆发或全球范围的流行，导致灾难性的后果。目前对抗流感病毒尚无特效药，少数有一定疗效的药物又多有毒副作用。中医古籍中没有流感病毒及流感病名的记载，根据其流行规律和致病特点，流感病毒相当于“温毒”“温热时毒”，流感属于“温病”“时行病”“疫疠”等范畴。银翘散源于清代医家吴鞠通所著《温病条辨》，具有辛凉解表、清热解毒的功效。方中主要药物连翘味苦、微寒，可清热解毒，消肿散结，主要用于风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑等症的治疗［1］。笔者对连翘体外、体内抗流感病毒作用进行系列研究，旨在阐明该药在中药复方银翘散中抗流感病毒作用的药理作用，为探求有效的中医药抗流感病毒方药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)，由中国预防医学科学院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医病毒室，经鼠肺、鸡胚传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。

1.2 鸡胚 9日龄尼克白种鸡胚，SPF级，购买于辽宁省益康生物制品厂。

1.3 动物 昆明种小鼠，雄性12～14 g，购自中国医科大学实验动物部，动物实验许可证号：SCXK (辽)2003-0009。

1.4 实验药品制备 连翘饮片(购自辽宁中医药大学附属医院药局)，加入80%乙醇14倍量，加热回流2小时，药渣再加80%乙醇10倍量，加热回流1小时，合并2次提取滤液，浓缩后烘干，研粉避光冷藏备用。用于体外实验时，以生理盐水配成浓度为400 mg(生药)/mL溶液，高速离心机4 000 r/min离心30分钟，取上清高温高压灭菌后4℃冷藏备用。病毒唑注射液(江苏吴中实业股份有限公司，批号：060208)。1%鸡红细胞悬液(采集健康公鸡血，阿氏液抗凝，离心洗涤弃上清，无菌生理盐水配制成1%悬液，4℃冷藏备用)［2］。

1.5 仪器 SG403TXCE型全外排Ⅱ级生物安全柜(美国Baker公司)；台式压力蒸汽灭菌器(沈阳盛达生物电子设备有限公司)；RM2135型精密轮转切片机(德国LEICA公司)；BX50F4型系统生物显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；DU-600型蛋白-核酸分析仪(美国Beckman公司)；PE-9600型PCR仪(美国PERKIN ELMER公司)；BIOFUGE28RS型低温高速离心机(德国HERAEUS公司)；EPS-300型电泳仪(上海天能公司)；天能凝胶分析系统；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；AS3120电子超声仪。

1.6 实验方法

1.6.1 连翘提取物体外抗流感病毒实验研究

1.6.1.1 流感病毒增毒及其在鸡胚上半数感染量(EID50)的测定 将病毒原液接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚接种0.1 mL，石蜡封口，33～35℃温箱孵育48小时，4℃过夜。收取尿囊液，红细胞凝集实验测血凝滴度。将增毒后的流感病毒原液系列对数稀释(10-1～10-12)，分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内，每个浓度接种4个鸡胚，并做生理盐水对照。将注射流感病毒的鸡胚放入33～35℃温箱内，48小时后取出放入4℃冰箱内过夜；收取尿囊液，每胚0.1 mL依次加入作好标记的血凝板上，再加入预先配制好的1%的鸡血球0.1 mL，轻摇后40分钟观察结果，用karber公式［2］计算。测得EID50为10-6.28，实验用100EID50。

1.6.1.2 连翘提取物及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒浓度(TD0)的测定 用含PS10%的生理盐水将药物原液作连续2倍系列稀释至1∶512浓度，每次抽取0.2 mL分别接种在预先作好标记的鸡胚上，每个浓度接种4个鸡胚，并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入33～35℃温箱内孵育48小时，每12小时观察记录鸡胚存活情况，24小时内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。因连翘提取物组自原液起未发现死亡鸡胚，故将原液浓度400 mg/mL作为药物最大无毒浓度，利巴韦林注射液最大无毒浓度：50 mg/mL。

1.6.1.3 连翘提取物对甲型流感病毒感染鸡胚的预防和保护作用研究 1)预防作用。药物原液自TD0开始2倍比稀释3个浓度(400、200、100 mg/mL)，每胚0.1 mL分别接种鸡胚，每个浓度8个鸡胚，37℃孵育2小时，并设生理盐水和病毒对照；然后分别接种0.1 mL的100EID50的病毒悬液，放入33～35℃温箱内48小时，4℃过夜。抽取尿囊液，测定血凝滴度。2)治疗作用。用100EID50病毒悬液接种鸡胚，33～35℃孵育2小时，再分别接种与预防实验同浓度的药液，每组8个鸡胚，并设生理盐水及病毒对照。33～35℃温箱内48小时，再以4℃过夜。抽取尿囊液，测定血凝滴度。

1.6.2 连翘提取物对流感病毒肺炎小鼠的治疗作用

1.6.2.1 甲型流感病毒FM1株对小鼠半数致死量(LD50)的测定［2］将增毒后的新鲜尿囊液10倍系列稀释6个浓度(10-1～10-6)；将30只昆明种小鼠随机分成6组，每组5只；在乙醚麻醉下经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株，每组接种同一个浓度(0.05 mL/只)；连续观察14天，记录小鼠死亡情况，并进行死亡百分率统计，应用Reed和Muench公式计算LD50为4.5。

1.6.2.2 动物分组 依据随机数字表法，将40只昆明种小鼠分为4组，分别为连翘治疗组(连翘组)10只、正常对照组(正常组)10只、病毒对照组(模型组)10只、病毒唑对照组(病毒唑组)10只。1.6.2.3 模型复制 除正常组外，各组均造模。依照文献［3-4］在乙醚麻醉下经鼻腔接种15LD50甲型流感病毒FM1株，每只0.05 mL，正常组在同等条件下接种等量不含病毒的生理盐水。

1.6.2.4 给药与饲养 将连翘提取物用蒸馏水配制成水溶剂，浓度为0.06 g生药/mL，于感染前1天，连翘组开始灌胃给药，1次/d，0.5 mL/次；西药对照组将病毒唑注射液以无菌生理盐水配成浓度为10 mg/mL，每次腹腔注射0.1 mL，1次/d。各组给药量相当于60 kg成人临床等效量。正常组和模型组均以等体积的生理盐水灌胃。所有动物在同一条件下(全外排Ⅱ级生物安全柜，室温20～24℃，相对湿度65%)，用普通饲料喂养，控制饮食，自由饮水。

1.6.2.5 标本取材 各组小鼠在感染第5天称重后断颈处死，处死前禁食禁水4小时以上。无菌条件下摘取肺脏。将肺组织放入无菌生理盐水中洗涤两次，用无菌滤纸吸干表面水分，观察病变程度，称出肺的质量，取左侧肺叶放入无菌EP管中，迅速置于冰壶中，在-80℃冰箱中保存用于RT-PCR检测；右侧肺叶用4%多聚甲醛固定用于组织病理检测。

1.6.2.6 模型鉴定及中药提取物对小鼠流感病毒性肺炎治疗作用 1)每天观察各组小鼠皮毛色泽、饮食、活动情况和精神状态，定期测量体质量。2)光镜下肺组织形态观察：将固定好的组织包埋成蜡块，切片机切片，常规脱蜡至水，苏木素、伊红染色，脱水封片，置显微镜下观察。3)肺指数：肺指数=小鼠肺质量(g)/小鼠体质量(g)×100%。4)RT-PCR法检测肺组织悬液IV总RNA表达。

1.7 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，多组的计量资料采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度连翘提取物对甲型流感病毒感染鸡胚预防和治疗作用 预防和治疗血凝效价因数连翘提取物组、阳性对照组与病毒对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；高浓度连翘提取物组与阳性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。预防血凝效价因子中、低浓度连翘提取物组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗血凝效价因子各浓度连翘提取物组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 不同浓度连翘提取物对流感病毒感染鸡胚的预防和治疗作用

表1 不同浓度连翘提取物对流感病毒感染鸡胚的预防和治疗作用

注：与病毒对照组比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与阳性对照组比，#表示P＜0.05，△表示P＞0.05。

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2.2 连翘提取物对流感病毒肺炎小鼠的治疗作用

2.2.1 肺指数改变 肺指数模型组与正常组、连翘组、病毒唑组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；病毒唑组与连翘组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺指数比较

表2 各组小鼠肺指数比较

注：与正常组比较，★★表示P＜0.01；与模型组比较，**表示P＜0.01；与病毒唑组比较，#表示P＜0.05，△表示P＞0.05。

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2.2.2 各组小鼠行为观察 正常组小鼠精神良好，毛发有光泽，活动敏捷，呼吸正常，饮食正常，体质量自然增长。模型组小鼠呼吸较急促，毛发无光泽，行动迟缓，抱团蜷缩，畏寒怕冷，饮食减少，明显消瘦。各浓度连翘组和病毒唑组，在感染后第2天出现轻微畏寒无力，呼吸较急促，毛发欠光泽，饮食减少，体质量下降，给药后第4天状态开始好转，活动和饮食增加，第5天症状明显减轻。

2.2.3 肺组织光镜病理组织学观察 正常组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡隔形态完整，周围血管未见炎细胞浸润；模型组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔等正常组织结构消失，肺泡间隔增厚、水肿，内含有大量炎细胞浸润，以淋巴细胞为主，肺泡壁毛细血管扩张，间见大量红细胞；连翘组病变明显减轻，肺泡及肺泡隔形态完整，但仍有肺泡间隔增厚，少量炎细胞浸润，结缔组织间可见少量红细胞，肺组织接近正常组；病毒唑组病变较其他各组轻，形态结构在各治疗组中最为完整，肺泡间隔增厚不明显，偶见炎细胞浸润，结缔组织间可见少量红细胞。见图1。

图1 肺组织光镜病理图片(HE，×200)

2.3 RT-PCR法检测各组小鼠肺组织IV-RNA表达 正常组肺组织中未检测到IV病毒核酸，病毒模型组在感染后第5天检测到大量IV RNA表达。病毒核酸含量连翘组、病毒唑组均低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)；病毒唑组与连翘组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3、图2。

表3 各组药物对肺组织中IV RNA表达的影响

表3 各组药物对肺组织中IV RNA表达的影响

注：★★表示与正常组比较，P＜0.01；**表示与模型组比较，P＜0.01；##表示与阳性对照组比较，P＜0.01。

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图2 各组小鼠肺组织中IV RNA扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

清代医家吴鞠通所著《温病条辨》中银翘散是中医临床广泛应用的抗流感病毒疗效确切的中药复方之一，其中君药连翘辛凉透邪，清热解毒，在方中的作用和地位历来被医家所重视［3-6］。石钺等［7］对银翘散抗流感病毒活性进行研究，筛选出了银翘散抗流感病毒的有效部位群，并通过对各单味药相应部位总黄酮的测定，探讨了各单味药对有效部位的贡献。结果表明，9味药中连翘、金银花、薄荷和荆芥对其贡献最大，进一步证实了连翘在银翘散中举足轻重的地位。

银翘散君药连翘提取物抗甲型流感病毒体内、体外实验是银翘散抗流感病毒系列研究的一部分，银翘散全方抗流感病毒作用在我们前期实验中已得到证实［8-9］。本实验结果表明，连翘提取物具有很强的直接杀灭流感病毒的作用，并且对流感病毒肺炎小鼠治疗作用效果显著。

中药抗病毒具有疗效显著、副作用少、作用靶点多等优势，加强对临床上疗效显著的传统复方中单味药的研究，并应用现代药理学方法弄清单味药中所含的化合物的种类、结构、理化性质及含量，是中医药现代化的发展方向。

［1］ 范为宇，张早华，苏大明，等.防治流感方药筛选的临床研究文献分析［J］.中国中医药信息杂志，2006，13(8)：99-100.

［2］ 郭元吉.流行性感冒病毒及实验技术［M］.北京：中国三峡出版社，1997：221.

［3］ 肖会敏，王四旺，王剑波，等.连翘抗病毒的研究进展［J］.中国医药导报，2010(2)：9-10.

［4］ 邹晓华，何伟康，戴安印，等.高效液相色谱法测定感冒热毒清合剂中连翘苷的含量［J］.中国医药导报，2015，12(15)：117-119.

［5］ 蔡清宇，唐慧慧.高效液相色谱法测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量［J］.中国中医药信息杂志，2016，23(2)：98-100.

［6］ 李双，王东强，李志军.连翘药理作用小议［J］.西部中医药，2012，25(1)：52-54.

［7］ 石钺，石任兵，刘斌，等.银翘散抗流感病毒有效部位群总黄酮含量的测定［J］.北京中医药大学学报，2001，24(2)：44-45.

［8］ 张振巍，张娜娜.清喉咽合剂中连翘苷不同定量方法对比分析［J］.中国中医药信息杂志，2013，20(3)：65-66.

［9］ 穆廷杰，杨芬兰，金海红，等.连翘等中草药对肺炎克雷伯菌抑菌作用的实验研究及临床应用［J］.西部中医药，2015，28(9)：19-21.

Experimental Study on LianQiao in Resisting Influenza A Virus in Vivo and Vitro

PAN Zhaozhao,WANG Xuefeng
Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine,Shenyang 110032,China

Objective: To observe the effects of LianQiao(fructus forsythiae) in resisting influenza A virus in vivo and vitro. Methods: The preventive effects and therapeutic effects of LianQiao with different concentrations on chicken embryro were observed after preparing chicken embryro with influenza A virus by injecting different concentrations of influenza A virus. mice pneumonia of inborn from kunming were induced by adopting inocualtion influenza A virus FM1 though nasal cavity, general state, lung index, lung histogical morphology, the influences on IV and RNA expressions were observed. Results: LianQiao can prevent proliferation of influenza virus in chicken embryro, the prevention effects decreased with concentration decreased, but there were no statistical differences between different concertrations(P＞0.05). LianQiao had treatment function for chicken embryo infected with IV, the treatment function decreased with concertration decreased, but there were no statistical differences between different concertrations(P＞0.05). LianQiao can improve the general state of pneumonia mice with influenza, relieve lung tissue lesion, inhibit replication of influenza in mice lung tissue. Conclusion: LianQiao extraction has the effects of resisting influenza in vitro and treatment function for pneumonia mice with influenza virus.

LianQiao; influenza A virus; chicken embryro; influenza viral pneumonia

R373.1

A

1004-6852(2016)12-0005-04

2016-04-08

国家教育部博士点基金课题(编号20040162004)；国家自然科学基金资助项目(编号30772880)。

潘曌曌(1976—)，女，博士学位，副主任医师。研究方向：中药抗病毒的临床及实验研究。