苍梧六堡茶与其他茶叶中酚酸的对比研究

陈磊，彭静静，滕建文，黄丽（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）



苍梧六堡茶与其他茶叶中酚酸的对比研究

陈磊，彭静静，滕建文，黄丽*
（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

摘要：选取苍梧盒装六堡茶、竹篓装六堡茶、云南普洱茶、桂平绿茶，以及福建乌龙茶作为研究对象，旨在探讨苍梧六堡茶与其他茶叶中酚酸含量及种类的不同。通过分离提取，结果说明了苍梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平绿茶和福建乌龙茶要低。其中苍梧盒装六堡茶、桂平绿茶和福建乌龙茶的50 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，分别为34.1%、60.0%、66.3%；苍梧竹篓装六堡茶的100%甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，为36.8%；云南普洱茶的10%甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，为17.8%。最后用HPLC分析检测酚酸，结果表明苍梧竹篓装六堡茶中存在两种含量较高的特征性酚酸，而云南普洱茶中也存在一种含量较高的特征性酚酸。相对于桂平绿茶和福建乌龙茶，属于黑茶的苍梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量较少，但却存在一些含量较多的特征性酚酸。

关键词：六堡茶；酚酸；分离纯化；色谱分析

茶多酚（Tea Po1yphenol，TPP）是一种稠环芳香烃，是茶叶中多酚类物质的总称，在茶叶中的含量一般为20 %～35 %，可分为黄烷醇类（其中儿茶素约占多酚类总量的60 %~80 %）、黄酮醇类、黄酮类、花色苷类（花青素、花白素等）和酚酸类（包括酚酸及缩酚酸）等。其中酚酸是一类分子中含有羧基和羟基的芳香族化合物；缩酚酸是由酚酸上的羧基与另一分子酚酸上的羟基相互作用缩合而成。茶叶中含有的酚酸和缩酚酸类化合物，经纸层析分离与鉴定，它们多为没食子酸、咖啡酸、鸡纳酸的缩合衍生物，总量大约占茶鲜叶干重的5 %[1]。在茶叶生化研究中，没食子酸作为黑茶尤其是普洱茶中的特征性酚类物质受到关注。没食子酸是茶多酚的重要组成单元，微生物分解和EGCG等酯型儿茶素的氧化分解等均能导致茶叶中没食子酸含量的增加[2]。

六堡茶的滋味物质主要是茶叶多酚类及其衍生物、氨基酸、咖啡碱和糖类等。黑茶中保留的多酚类物质较少，多数为游离型儿茶素，故苦涩味较轻。由于多酚类物质和辛辣的茶黄素（儿茶素的氧化物）较少，而刺激性较弱的茶红素、茶褐素含量较多，因而使黑茶滋味变得醇和。目前对六堡茶的研究主要为基本的理化特性和生产工艺的优化两方面，对于六堡茶中酚酸类物质的深入研究鲜见报道。因此本文从六堡茶酚酸的提取、分离纯化、测定及与其他茶样的对比等方面做了更加系统的研究，从而为六堡茶的风味功能研究和市场开发利用提供更全面的科学参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验原料

苍梧盒装六堡茶（紧压饼茶，2006年生产）、苍梧竹篓装六堡茶（紧压茶饼，产期未标注）：苍梧六堡茶茶业有限公司；云南普洱茶（紧压饼茶，2009年生产）：昆明新购商贸有限公司；桂平绿茶（散茶，2010年生产）：桂平市西山碧香茶厂；福建乌龙茶（散茶，2010年生产）：南宁市绿野茶业有限责任公司。茶样的预处理参照GB/T 8303-2013《茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定》[3]。

1.1.2试验仪器

RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SB-5200DT型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；MJ-250PP018型榨汁搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；LD10-2.4A型高速离心机：北京医用离心机厂；721W型可见分光光度计：上海光学仪器厂；Series 200型高效液相色谱仪：PerkinElmer公司；60目和100目的标准检验筛（孔径分别为0.3mm和0.15mm）：浙江上虞市道墟开发筛具厂。

1.1.3药品试剂

甲醇（AR，色谱纯）、盐酸、二水钨酸钠（AR）：国药集团化学试剂有限公司；HP-20大孔吸附树脂、磷酸、一水合硫酸锂、溴水、无水乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠（AR）：广东光华化学厂有限公司；钼酸钠（AR）：广东台山化工厂；没食子酸（AR）：上海润捷；无水碳酸钠（AR）：广州医药站化学试剂综合公司。

1.2方法

1.2.1茶叶干物质含量的测定

将称量皿预处理并采用103℃恒重法计算茶叶的干物质含量[3-4]。

1.2.2茶多酚总量的测定

采用Folin-Ciocalteu法[5]测定茶多酚含量。

1.2.3酚酸类物质的提纯及分离测定

1.2.3.1酚酸类物质的提取

酚酸（酸性酚）用70 %的乙醇提取和乙酸乙酯分离萃取[6]。

1.2.3.2酚酸类物质的洗脱分离

HP-20大孔吸附树脂的预处理参照文献[7]。先用两个柱体积（即2×90 mL）的蒸馏水洗涤树脂，除去一些氨基酸、多糖类的大分子物质。再分别用两个柱体积10 %、30 %、50 %、100 %的甲醇对各个茶样进行逐级洗脱，洗脱速度约为2 mL/min。收集不同浓度甲醇洗脱得到的洗脱液，记录体积。测定所得洗脱液的干物质含量和吸光度，再计算洗脱分离后各个茶样液中酚酸类物质的纯度。

1.2.3.3酚酸纯度的计算

式中：A为样品测试液吸光度；V为样品提取液体积或甲醇洗脱液体积，mL；d为稀释因子；SLOPEStd为没食子酸标准曲线的斜率；m2为5 mL甲醇提取液或甲醇洗脱液的可溶性固形物含量，g。

1.2.3.4酚酸类物质的色谱分析

经过大孔吸附树脂提纯后得到的甲醇洗脱液，取各个茶样中酚酸纯度最高的洗脱液旋转蒸发至近干，用甲醇（色谱纯）溶解定容至5.0 mL。经有机系微膜（0.22 μm）过滤后，待分析。高效液相色谱条件为：（1）色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（2）流速：1.0mL/min；（3）柱温：25℃；（4）检测波长：320nm[8]；（5）进样体积：5 μL；（6）流动相：以0.1 %磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B；（7）梯度洗脱具体如表1所示。

表1梯度洗脱程序Table 1 Gradient Dilution Program

2结果与分析

2.1 5种茶样中茶多酚的总量分析

2.1.1没食子酸标准曲线方程

以吸光值（A765 nm）为纵坐标，以没食子酸浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得出回归方程y= 0.013 8x+0.007 6，R2=0.999 5。

2.1.2各茶样的干物质含量及茶多酚总量

按1.2.1和1.2.2的方法分别测定苍梧盒装六堡茶、苍梧竹篓装六堡、云南普洱茶、桂平绿茶及福建乌龙的干物质含量m（%）和茶多酚含量（干基），具体结果见表2。

表2各种茶样的干物质含量及茶多酚总量Table 2 The dry matter content and tea polyphenols content of different tea

从茶叶的干物质含量看，属于后发酵茶的苍梧六堡茶和云南普洱茶比福建乌龙茶和桂平绿茶要低；但苍梧盒装六堡茶比竹篓装六堡茶高，保留了更多的成分。从茶多酚总含量测定结果可知，苍梧盒装六堡茶比竹篓装六堡茶高6.5 %，保留了更多的茶多酚；苍梧盒装六堡茶要比桂平绿茶（非发酵茶）和福建乌龙茶（半发酵茶）低一些，但明显比同是黑茶的云南普洱茶（发酵茶）高出7.1 %。

2.2酚酸的纯度及含量计算

按1.2.3.2的方法用HP-20大孔吸附树脂和不同浓度的甲醇将酚酸类物质洗脱分离后，测定其干物质含量并再按1.2.3.3的方法计算纯度，具体结果见表3。

表3不同甲醇洗脱液的酚酸纯度Table 3 The purity of phenolic acid in different concentrations

从表3可以看出，在5种茶样提取液进入液相分析前，先用大孔吸附树脂提纯，结果表明，苍梧盒装六堡茶、桂平绿茶和福建乌龙茶的50 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，苍梧竹篓装六堡茶的100 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，云南普洱茶的10 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，其酚酸纯度分别为34.1 %，60.0 %，66.3 %，36.8 %和17.8 %，表明苍梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平绿茶和福建乌龙茶要低。

2.3 5种茶样中酚酸类物质的色谱分析

2.3.1分析样液的预处理

将5种茶叶的50 %甲醇洗脱液、苍梧竹篓装六堡茶100 %甲醇洗脱液和云南普洱茶10 %甲醇洗脱液共7个洗脱液蒸发至近干，用色谱纯甲醇定容至5 mL，经有机系微膜（0.22 μm）过滤后，待分析。

2.3.2液相合并图谱分析

将5种茶叶中酚酸纯度最高的甲醇洗脱液的HPLC图谱合并起来，得到图1。按照1.2.3.4酚酸类物质的色谱分析法，对2.3.1中7个待测液的计算机合并图谱分析如图1所示。

图1 5种茶叶的合并图谱Fig.1 The HPLC chromatograms of five different tea

根据图谱分析得出：（1）桂平绿茶和福建乌龙茶的50 %甲醇洗脱液均在第23、29、36、43 min有4个显著的峰值（图中的2号、3号、4号和5号峰）；从保留时间上看，这两种茶叶中主要酚酸类物质的种类基本一致。（2）云南普洱茶的10 %甲醇洗脱液和50 %甲醇洗脱液均在第6 min有一个明显而独特的峰值（图中的1号峰），说明云南普洱茶中该种特征性酚酸的含量比其他4种茶样都要高。（3）苍梧盒装六堡茶和竹篓装六堡茶的50 %甲醇洗脱液均在第43 min有一个显著的峰值（图中的4号峰），说明苍梧六堡茶与桂平绿茶、福建乌龙茶含有同种酚酸类物质。（4）苍梧竹篓装六堡茶的100 %甲醇洗脱液在第44、45 min有两个明显而独特的峰值（图中的6号和7号峰），说明苍梧竹篓装六堡茶中这两种特征性酚酸的含量比其他4种茶样都要高。以上结果提示，虽然相对于桂平绿茶和福建乌龙茶，属于黑茶的苍梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量较少，但却存在一些含量较多的特征性酚酸。

3　总结

通过分析测定，我们发现苍梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平绿茶和福建乌龙茶要低。其中苍梧盒装六堡茶、桂平绿茶和福建乌龙茶的50 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，分别为34.1 %、60.0 %、66.3 %；苍梧竹篓装六堡茶的100 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，为36.8 %；云南普洱茶的10 %甲醇洗脱液中酚酸纯度最高，为17.8 %。最后利用HPLC法分析了每种茶样中具有的特殊酚酸，结果表明苍梧竹篓装六堡茶中存在两种含量较高的特征性酚酸，而云南普洱茶中也存在一种含量较高的特征性酚酸。结果提示，相对于桂平绿茶和福建乌龙茶，属于黑茶的苍梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量较少，但却存在一些含量较多的特征性酚酸。

4　讨论

4.1影响黑茶中茶多酚含量的主要因素

黑茶中的茶多酚含量与其制作过程中的发酵作用和贮藏过程中的温度、湿度、光线以及包装材料等密切相关[9-12]。因为在发酵过程中，微生物所分泌的多酚氧化酶，促进了茶叶中多酚类物质的氧化，氧化产物进而聚合生成与茶汤品质特征相关的化学物质。随着发酵的不断进行，茶多酚的含量就越少，故试验中所选取的黑茶（苍梧六堡茶和云南普洱茶）的茶多酚含量比非发酵桂平绿茶以及半发酵福建乌龙茶的茶多酚含量少。另外，由于竹篓有空隙，使得茶叶在贮藏过程中接触空气的时间较长，受到温度、湿度等环境因素的影响较大，所以苍梧竹篓装六堡茶的茶多酚含量比苍梧盒装六堡茶的茶多酚含量低。但是苍梧竹篓装六堡茶的茶多酚总量却比云南普洱茶的高0.6 %，有可能是因为云南普洱茶的发酵更为彻底。

4.2酚酸的提纯机理及效果探讨

在纯化酚类物质时，HP-20大孔树脂[13]通过与茶多酚提取液中有机物疏水部分的相互作用来吸附茶多酚类物质（酚酸等）；水洗完毕后采用非极性的甲醇有机溶剂作为洗脱液，其中疏水性较弱的物质与树脂的吸附作用较小，就先被甲醇洗脱出来，后面随着甲醇洗脱液浓度的提高，疏水性较强的物质就被慢慢洗脱出来，从而达到分离提纯的效果。然而，实验中云南普洱茶各个浓度的甲醇洗脱液的酚酸纯度均比使用大孔树脂分离纯化前要低，有可能是因为甲醇将普洱茶中的酚酸类物质分散洗脱于各个浓度梯度里，使得普洱茶中的酚酸类物质无法集中到一个浓度的甲醇里，所以酚酸纯度比过柱前有所下降。

参考文献：

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The Comparative Study of Phenolic Acids among Cangwu Liubao Tea and Other Teas

CHEN Lei，PENG Jing-jing，TENG Jian-wen，HUANG Li*
（Light Industry and Food Engineering College，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China）

Abstract：This research chose Cangwu boxed Liubao tea，Cangwu bamboo packed Liubao tea，Yunnan Pu'er，Guiping green tea and Fujian oolong tea as objects to study the differences of phenolic acids' content and type among Cangwu Liubao tea and other teas. After extraction and purification，the optimal phenolic acids purity was turned to be as follows：the 50 % methanol elution of Cangwu boxed Liubao tea，Guiping green tea and Fujian oolong tea were all highest，and so were the 100 % elution of Cangwu bamboo packed Liubao tea and 10 % elution of Yunnan Pu'er. Their purity was 34.1 %，60.0 %，66.3 %，36.8 % and 17.8 % respectively，which indicated the phenolic acids amount of Cangwu Liubao tea was more than Yunnan Pu'er but less than Guiping green tea and Fujian oolong tea. HPLC was lastly applied in the later analysis. The results showed that Cangwu bamboo packed Liubao tea contained two high content featured phenolic acids，and there was also a high content featured phenolic acid in Yunnan Pu'er. The above results indicated that Cangwu Liubao tea and Yunnan Pu'er which belong to dark tea had less phenolic acids compared to Guiping green tea and Fujian oolong tea，but they had some high content featured phenolic acids.

Key words：Liubao tea；phenolic acids；extraction and purification；chromatographic analysis

收稿日期：2014-08-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.034

*通信作者

作者简介：陈磊（1991—），男（汉），硕士研究生在读，研究方向：食品科学。

基金项目：广西青年基金项目（2012GXNSFBA053024）