祁州漏芦对D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤的保护作用

金明，高峰，金梅花，全吉淑（延边大学医学院，吉林延吉133002）



祁州漏芦对D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤的保护作用

金明，高峰，金梅花，全吉淑*
（延边大学医学院，吉林延吉133002）

摘要：研究祁州漏芦提取物对D-氨基半乳糖（GalN）诱发的小鼠急性肝损伤的保护作用。将小鼠随机分为正常组、模型组、联苯双脂组、祁州漏芦乙醇提取物组、祁州漏芦正丁醇层萃取物组和水层萃取物组。每日给药1次，连续7 d。实验末期，腹腔注射GalN建立急性肝损伤模型。比色法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）以及肝脏诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）水平。祁州漏芦不同溶剂层提取物显著降低GalN致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性（P＜0.05）；降低肝组织iNOS和NO水平，降低肝线粒体MDA水平（P＜0.05）；升高肝线粒体GPx、SOD活性和GSH水平（P＜0.05）。祁州漏芦提取物对GalN致急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化和抗炎作用有关。

关键词：祁州漏芦；D-氨基半乳糖；肝损伤；抗氧化

祁州漏芦（Rhaponticum uniflorum（L.）DC）为多年生草本，分布于我国东北、内蒙古、陕西、河北、甘肃等地区。具有清热解毒、排脓消肿、通乳的功能，主治乳腺炎、腮腺炎、风湿性关节炎、淋巴结结核、痔疮等[1]。研究表明，祁州漏芦具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增强免疫及抗肿瘤等药理作用[2-4]。近年来，祁州漏芦在肝病防治中的应用也越来越受关注。研究表明，祁州漏芦对四氯化碳以及对乙酰氨基酚所致化学性肝损伤具有保护作用[5-6]。本文将研究祁州漏芦不同溶剂萃取物对D-氨基半乳糖（GalN）致小鼠急性肝损伤的干预作用，探讨祁州漏芦的保肝作用机制。

1材料与方法

1.1材料

实验动物选用雄性昆明小鼠：延边大学实验动物中心[体重22 g~26 g，合格证号：SCXK（吉）2008-0005]。GalN：（批号：085k1321）Sigma公司；联苯双脂（BFD）滴丸（批号：20091024）：北京协和药厂；兔诱导型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗体：美国Abcam公司；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）及蛋白质测试盒：购于南京建成科技有限公司。

3-30K型离心机：德国Sigma公司；S22PC型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品；DYY-12型电泳仪、DYCP-31D型电泳槽、DYCZ-24DN型电泳仪：北京六一仪器厂；Trans-Blot转印槽：美国Bio-Rad公司；UVP凝胶成像分析仪：美国UVP公司。

1.2方法

1.2.1祁州漏芦的提取工艺

祁州漏芦采自吉林省长白山，经延边大学药学院刘勇镇教授鉴定为祁州漏芦Rhaponticum uniflorum （L.）DC。将祁州漏芦切碎后，用90%乙醇回流提取2h，共3次，合并滤液，经减压浓缩即得祁州漏芦乙醇提取物（RUEE），得率为8.7 %。将乙醇提取物加水溶解，用等体积乙酸乙酯和正丁醇萃取，得正丁醇层萃取物（RUBF）和水层萃取物（RUAF）[4]。

1.2.2模型的复制与分组、给药

将小鼠随机分为6组，即正常组、模型组、RUEE组、RUBF组、RUAF组和BFD（联苯双酯）组（阳性对照组）。治疗组小鼠按200 mg/（kg·d）剂量灌胃给药，BFD组按100 mg/（kg·d）剂量灌胃给药，每日1次，连续7 d。药物的剂量选择主要根据课题组前期研究及预实验结果而定的[2，5-6]。正常组及模型组小鼠则灌胃等体积生理盐水。末次给药1h后，除正常组腹腔注射等体积生理盐水外，其余各组小鼠一次性腹腔注射给予500 mg/kg GalN。造模期间禁食，不禁水。

1.2.3血清生化指标的检测

造模24 h后处死小鼠，眼球取血，分离血清，检测小鼠血清ALT、AST活性。

1.2.4肝组织抗炎、抗氧化指标及DNA损伤的检测

常规方法制备肝线粒体。肝组织用磷酸盐缓冲盐水在冰浴中均质处理，600 r/min离心取上清为肝匀浆。肝匀浆在10 000 r/min离心，取沉淀悬浮于磷酸盐缓冲液中，用超声波处理，在8 000 r/min离心得肝线粒体液。按照各测试盒操作方法测定iNOS、NO、MDA、GSH、GPx、SOD及蛋白质水平。

1.2.5统计学处理

2结果与分析

2.1祁州漏芦提取物对肝损伤小鼠血清ALT、AST活性的影响

血清ALT和AST是评价急性肝损伤程度的常用指标，见表1。

表1祁州漏芦提取物对血清ALT和AST活性的影响Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

表1祁州漏芦提取物对血清ALT和AST活性的影响Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

注：-表示无剂量；与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

组别　　剂量/（mg/kg）　ALT/（μmol/s·L）　AST/（μmol/s·L）正常组　　－　3.65±0.63　4.96±0.97模型组　　－　15.3±1.94*　10.4±1.45*RUEE组　200　10.8±1.63#　7.5±1.34#RUBF组　200　10.1±1.85#　6.4±1.29#RUAF组　200　11.6±2.02#　7.7±1.42#BFD组　100　9.23±1.27#　6.1±1.23#

由表1可见，与正常组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性升高（P＜0.05）。与模型组比较，RUEE、RUBF和RUAF组小鼠血清ALT和AST活性降低（P＜0.05）。单纯从转氨酶指标来看，RUAF与RUBF的保肝活性差不多，较弱于BFD。

2.2祁州漏芦提取物对肝损伤小鼠肝线粒体GPx、SOD、GSH和MDA水平的影响

GalN经不同途径导致膜结构破坏，引起细胞内钙离子增加，抑制线粒体呼吸功能，产生氧自由基和氧化应激。结果见表2。

表2祁州漏芦提取物对肝线粒体GPx、SOD、GSH和MDA水平的影响Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

表2祁州漏芦提取物对肝线粒体GPx、SOD、GSH和MDA水平的影响Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

注：-表示无剂量；与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

组别　　剂量/ （mg/kg）GPx/ （U/mg）SOD/ （U/mg）GSH/ （nmol/mg）MDA/ （nmol/mg）正常组　　－　187.1±28.3 65.3±10.6 38.7±4.3　 2.31±0.42模型组　　－　130.3±20.4*40.2±8.5*24.4±3.7*3.57±0.75*RUEE组　200　 168.5±20.3#49.8±8.3#31.6±5.4#2.68±0.52#RUBF组　200　 175.2±24.9#51.8±9.2#34.2±6.1#2.69±0.46#RUAF组　200　 153.4±23.4#53.7±10.3#32.7±4.7#2.53±0.59#BFD组　100　 192.1±25.6#60.4±10.4#34.5±5.6#1.28±0.37#

由表2可见，与正常组比较，模型组小鼠肝线粒体GPx、SOD、GSH水平降低（P<0.05），MDA含量增高（P<0.05）；与模型组比较，RUEE组、RUBF组和RUAF组肝线粒体GPx、SOD、GSH含量增高（P<0.05），MDA水平降低（P<0.05）。

2.3祁州漏芦提取物对急性肝损伤小鼠肝组织iNOS 及NO水平的影响

祁州漏芦提取物对肝组织iNOS蛋白水平的影响结果见表3和图1。

表3祁州漏芦提取物对肝组织iNOS活性和NO水平的影响Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

表3祁州漏芦提取物对肝组织iNOS活性和NO水平的影响Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

注：-表示无剂量；与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

组别　　剂量/（mg/kg）　iNOS/（U/mg）　NO/（μmol/g）正常组　　－　0.25±0.07　2.7±0.6模型组　　－　0.64±0.12*　 7.8±1.1*RUEE组　200　0.37±0.08#　 4.6±0.9#RUBF组　200　0.38±0.07#　 5.5±1.1#RUAF组　200　0.35±0.06#　 5.2±1.0#BFD组　100　0.31±0.07#　 4.6±0.7#

图1祁州漏芦提取物对肝组织iNOS蛋白水平的影响Fig.1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on protein expression of iNOS in liver注：与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

与正常组比较，模型组小鼠肝组织iNOS蛋白表达及活性显著升高（P＜0.05）；NO水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，RUEE组、RUBF组和RUAF组小鼠肝iNOS蛋白表达和活性、以及NO水平显著降低（P＜0.05）。

3　讨论

GalN可造成肝弥漫性坏死和炎症，其所致急性肝损伤模型与人类病毒性肝炎的病理学变化相似，是筛选保肝药物和研究药物作用机制的经典动物模型。GalN是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，通过竞争生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭，导致肝细胞代谢障碍，造成肝脏弥漫性坏死和炎症，其肝脏病理和生化改变与人类病毒性肝炎极为相似，是保肝、降酶新药药理实验首选实验动物模型[7]。GalN经不同途径导致膜结构破坏，引起细胞内钙离子增加，抑制线粒体呼吸功能，产生氧自由基。而AST和ALT的活性变化成为最常用的判定药物护肝作用及药物抗氧化作用的重要指标。一般认为，ALT活性上升作为肝细胞浆膜损伤的标志，而AST活性作为线粒体损伤的重要指标，因为AST主要来源于线粒体[8-9]。本实验中，模型组小鼠血清ALT、AST水平升高，而祁州漏芦萃取物预处理组小鼠血清ALT、AST活性降低，提示祁州漏芦萃取物可减轻GalN所致小鼠急性肝损伤程度。在炎症反应中NO大量释放也被人们关注和广泛研究。NO可直接抑制线粒体呼吸，使肝细胞内能量代谢障碍而引起肝细胞凋亡和坏死[10]。本实验结果表明，GalN处理可增高肝损伤小鼠肝组织iNOS活性和NO水平，而祁州漏芦萃取物预处理可降低肝iNOS活性和NO水平，从而减少炎症反应的发生。同时，模型组小鼠肝线粒体MDA水平升高，肝线粒体SOD、GPx、GSH水平降低，表明急性肝损伤小鼠肝细胞存在一定程度的氧化应激损伤[11]。而祁州漏芦萃取物预处理组小鼠肝线粒体MDA水平降低，GSH含量和抗氧化酶活性增高。综上所述，祁州漏芦萃取物对GalN所致小鼠急性肝损伤具有保护作用，可通过清除机体内自由基和抑制脂质过氧化，进而保护肝细胞免受氧化应激损伤。其不同萃取物保肝活性相近，这与RUBF的体外抗氧化活性较高于RUAF的结果不吻合[2]。这可能与其成分的复杂性、体内外抗氧化作用不完全一致有关。其原因还需进一步研究。

参考文献：

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Protective Effect of Rhaponticum uniflorum on Acute Liver Injury Induced by D-Galactoamine in Mice

JIN Ming，GAO Feng，JIN Mei-hua，QUAN Ji-shu*
（Medical College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：To investigate the protective effect of Rhaponticum uniflorum extracts on liver injury induced by D-galactoamine（GalN）inmice，micewererandomlyassignedtothenormalcontrol，model，bifendate，Rhaponticum uniflorum ethanol extract，as well as the butanol（RUBF）and aqueous fractions of Rhaponticum uniflorum. Animals were treated once daily for 7 days. At the end of the experiment，GalN was given intraperitoneally to the mice of groups，then the alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），inducible nitric oxide synthase（iNOS），nitric oxide（NO），malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH），glutathione peroxidase（GPx）and superoxide dismutase（SOD）were detected with the colorimetric method. The results showed that the administration with different solvent fractions of Rhaponticum uniflorum reduced the serum activities of ALT and AST（P＜0.05），decreased hepatic iNOS and NO level，decreased the MDA content and increased GPx，SOD and GSH levels of liver mitochondria in mice with acute liver injury（P＜0.05）. This study showed that Rhaponticum uniflorum extracts had protective effects on acute liver injury induced by GalN in mice，probably via anti-oxidative and anti-inflammatory activities.

Key words：Rhaponticum uniflorum；D-galactoamine；liver injury；anti-oxidative

收稿日期：2014-09-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.001

*通信作者：全吉淑（1968—），女（朝鲜），教授，博士，研究方向：中药药理学。

作者简介：金明（1972—），女（朝鲜），副教授，博士，研究方向：中药药理学。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81160539）