HPLC法同时测定产灵丸中4种有效成分

王　坚，徐　菁，李　鹏，朱　军*

1.湖北医药学院附属东风医院药学部，湖北 十堰 442008；2.湖北医药学院药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008



HPLC法同时测定产灵丸中4种有效成分

王坚1,2，徐菁1,2，李鹏1,2，朱军1,2*

1.湖北医药学院附属东风医院药学部，湖北 十堰 442008；2.湖北医药学院药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008

[摘要]目的建立同时测定产灵丸(防风、苍术、白术等19味药物)中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素4种成分的高效液相色谱法。方法色谱柱为依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱；流速为1.3 mL/min；检测波长：254 nm (升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷)、337 nm (苍术素醇、苍术素)；柱温为30 ℃。结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素质量浓度分别在5.22~104.40 μg/mL (r=0.999 3)、4.95~99.00 μg/mL (r=0.999 7)、4.89~97.80 μg/mL (r=0.999 5)、6.34~126.80 μg/mL (r=0.999 2)时与其峰面积线性关系良好；平均加样回收率分别为98.79%、97.21%、100.07%、96.90%，RSD (n=6)分别为1.19%、1.13%、0.89%、0.85%。结论该定量测定方法简便、结果准确可靠并且重现性好，可作为产灵丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素的质量控制。

[关键词]产灵丸；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷；苍术素醇；苍术素

0引言

产灵丸由防风、苍术、白术、人参、当归、川芎、何首乌(黑豆酒炙)、荆芥穗、麻黄、川乌(银花甘草炙)、草乌(银花甘草炙)、白芷、细辛、八角茴香、木香、两头尖、桔梗、血竭、甘草(蜜炙) 19味药物组成，具有益气养血、散风止痛的功效，主要治疗产后气血虚弱、感受风寒引起的周身疼痛、头目眩晕、恶心呕吐、四肢浮肿等疾病[1-2]。防风、苍术、白术为方中的主要药物，原标准(中药成方制剂第十册)仅对方中麻黄所含的盐酸麻黄碱进行了定性鉴别研究，未对该制剂处方中任何组分进行定量研究，产灵丸中有效成分的定量研究目前也未见报道，而仅一味药的定性并不能有效控制该方质量的一致性和产品的疗效，本试验采用高效液相梯度洗脱法对产灵丸中主药防风所含升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和苍术、白术所含苍术素醇、苍术素开展同时定量方法学研究，为改进产灵丸的制剂质量标准提供可行性方法。

1仪器与试药

1.1仪器安捷伦1200型HPLC色谱仪(美国安捷伦公司)；SY-360型实验室超声波提取器(上海宁商超声仪器有限公司)。

1.2试药升麻素苷对照品(批号：111522-201310，含量以95.0%计，常温干燥、遮光密闭保存)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：111523-201208，含量以96.4%计，室温保存)、苍术素(批号：111924-201404，含量以99.7%计，冷冻、遮光)均购于中国食品药品检定研究院；苍术素醇(批号：61642-89-5，纯度：98.0%)购于上海士锋生物科技有限公司；产灵丸(规格：每100粒重21 g；批号：13022088、13091062、14021007)购于北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；甲醇、乙腈均采用色谱纯，采购于天津市大茂化学试剂厂。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：采用依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈作为流动相A相，水作为流动相B相，按照比例进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序见表1[3-8]；检测波长(0~24 min，λ1=254 nm[9-11]，24~44 min，λ2=337 nm[12])；柱温为30 ℃；进样量20 μL。在以上色谱条件下，待测成分峰与相邻峰之间的分离度均>1.5，理论塔板数按5-O-甲基维斯阿米醇苷计不得低于3 000。

表1　流动相梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取对照品升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素适量，精密称定，分别用甲醇进行溶解并定容，制成升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素质量浓度分别为0.522、0.495、0.489、0.634 mg/mL的4种对照品储备液。依次分别精密吸取上述各储备液2.5、2.0、5.0、7.5 mL置于同一个50 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，制成升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇与苍术素质量浓度分别为0.026 1、0.019 8、0.048 9、0.095 1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备随机取产灵丸10 g，剪碎，取5.0 g左右，精密称定，置于50 mL量瓶中，加入精密量取甲醇50 mL，称定总重量并记录具体数据，超声处理60 min，放置室温，再称定其总重量并记录具体数据，缺失的部分以甲醇补充至原重量，摇匀，用0.45 μm滤头过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液的制备严格按照产灵丸质量标准中规定的处方和制备工艺，分别称取除防风的其余药味、除苍术和白术的其余药味各1份，并分别制备与产灵丸工艺一致的防风空白样品和苍术白术空白样品。空白样品同“2.2.2”项方法，分别制成防风空白溶液和苍术白术空白溶液。

2.3专属性实验分别精密吸取上述供试品溶液、混合对照品溶液、防风空白溶液和苍术白术空白溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果表明，产灵丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素对照品与其他组分均能达到基线分离，同时供试品溶液色谱图与对照品相应位置处有吸收峰，而空白溶液色谱图在对照品相应位置处无吸收峰，色谱图见图1。

2.4线性关系考察精密量取对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，摇匀，配成系列浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，通过图谱获得各对照品相应峰面积A，并根据各对照品质量浓度C，得回归方程分别为：升麻素苷A=3.025 4×105C-195.7，r=0.999 3，线性范围5.22~104.40 μg/mL；5-O-甲基维斯阿米醇苷A=2.961 7×105C+306.5，r=0.999 7，线性范围4.95~99.00 μg/mL；苍术素醇A=7.040 9×105C+513.6，r=0.999 5，线性范围4.89~97.80 μg/mL；苍术素A=1.021 8×106C+584.2，r=0.999 2，线性范围6.34~126.80 μg/mL。结果表明，在相应的线性范围，4种成分的质量浓度与色谱峰面积有良好的线性关系。

2.5进样精密度试验精密吸取混合对照品溶液(升麻素苷0.026 1 mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.019 8 mg/mL、苍术素醇0.048 9 mg/mL、苍术素0.095 1 mg/mL) 20 μL，连续进样6次，分别测得4种成分的峰面积，计算各成分相对标准偏差，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素的RSD分别为1.39%、0.84%、1.62%、0.57%，结果表明，该仪器精密度良好。

2.6重复性考察称取适量同一批号的产灵丸作为供试品，分别制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算峰面积，通过线性方程获得各成分含量和相对标准偏差，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素的RSD分别为1.27%、0.95%、1.42%和0.69%。

图1　升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素的HPLC色谱图

2.7供试品溶液的稳定性考察取同一批号的产灵丸制备的供试品溶液，将其分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”项下色谱条件进行测定，每次进样量为20 μL，测定相应的峰面积值，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素的RSD分别为0.96%、1.08%、1.53%、0.44%，表明24 h内产灵丸供试品溶液具有良好的稳定性。

2.8加样回收率试验称取已知质量的产灵丸(升麻素苷为0.279 mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇苷为0.208 mg/g、苍术素醇为0.502 mg/g、苍术素为0.947 mg/g) 5 g，剪碎，取2.5 g左右，精密称定，置于50 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL、甲醇溶液25 mL，精密称定并记录具体数据，超声处理60 min，放置室温，再精密称定并记录具体数据，重量缺失部分以甲醇补充至原重量，摇匀，用0.45 μm滤头过滤，取续滤液，作为加样供试品试液。按“2.1”项下色谱条件测定，分别计算所测各组分回收率、平均回收率及RSD值，结果见表2。

表2　升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苍术素醇和苍术素回收率试验

2.9样品测定取3个不同批号的产灵丸样品，按“2.2.2”项法、按“2.1”项色谱条件测定4种成分含量，结果见表3。

表3　含量测定结果(mg/g)

3讨论

3.1指标成分的确定苍术和防风是产灵丸方中的主要药物，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风药材中的主要成分，属于色原酮类化合物，2010版药典将升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷作为防风药材的指标成分；苍术素醇和苍术素为苍术药材中的主要成分，同时方中白术也含有苍术素，本文采用高效液相梯度洗脱法对产灵丸中4种成分进行定量研究，利于确保该制剂的产品质量，为提高该制剂的质量标准提供依据。

3.2流动相的选择在流动相的选择中，笔者还曾考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸溶液[6]、甲醇-水[9-11]、乙腈-水[3-5,7-8]为流动相梯度洗脱，结果以乙腈-0.3%磷酸溶液梯度洗脱时，苍术素醇和苍术素与其他峰分离效果较好，但升麻素苷峰型不对称；以甲醇-水为流动相梯度洗脱，苍术素醇和苍术素达不到基线分离，拖尾现象严重；以乙腈-水为流动相梯度洗脱时，所测各组分峰型良好，各组分均能达到基线分离，分离度均>1.5。

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Simultaneous determination of prim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin in chanling pill by HPLCWANG Jian1,2,XU Jing1,2,LI Peng1,2,ZHU Jun1,2*(1.Department of Pharmacy,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei Medical University,Shiyan 442008,China;2.Institute of Pharmaceutical Analysis and Drug Screening,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of prim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin in chanling pill.MethodsThe Hypersil C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used. The mobile phase was composed of acetonitrile-water at the flow rate of 1.3 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm for prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methylvisammioside,337 nm for atractylodinol and atractylodin. The column temperature was 30 ℃.ResultsPrim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin had good linearity at 5.22~104.40 μg/mL (r=0.999 3),4.95~99.00 μg/mL (r=0.999 7),4.89~97.80 μg/mL (r=0.999 5),6.34~126.80 μg/mL (r=0.999 2) respectively. The average recoveries andRSDwere 98.79% (1.19%),97.21% (1.13%),100.07% (0.89%) and 96.90% (0.85%) respectively.ConclusionThe method is simple,accurate and reliable,it can be used for the quality control of chanling pill.

Key words：Chanling pill;Prim-O-glucosylcimifugin;5-O-methylvisammioside;Atractylodinol;Atractylodin

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601019

*通信作者

收稿日期：2015-04-17