丹参酮ⅡA磺酸钠治疗先天性人巨细胞病毒性肝炎小鼠的实验研究

雷尚芳，白　娜，鲍升娟，雷尚林

1.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)感染科，湖北 十堰 442000;2.湖北省十堰市张湾区花果医院，湖北 十堰 442000;3.湖北省十堰市张湾区卫生监督局，湖北 十堰 442000



丹参酮ⅡA磺酸钠治疗先天性人巨细胞病毒性肝炎小鼠的实验研究

雷尚芳1，白娜1，鲍升娟2，雷尚林3*

1.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)感染科，湖北 十堰 442000;2.湖北省十堰市张湾区花果医院，湖北 十堰 442000;3.湖北省十堰市张湾区卫生监督局，湖北 十堰 442000

[摘要]目的建立小鼠先天性人巨细胞病毒肝炎动物模型，研究丹参酮ⅡA磺酸钠的治疗机制，为治疗人类感染先天性巨细胞病毒肝炎的合理用药提供理论依据。方法Balb/c小鼠80只(雌雄各半)，配对后随机分对照组、病毒感染组、丹参酮大剂量组、丹参酮小剂量组，丹参酮大、小剂量组经腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠1、0.5 mg/(10 g·d)，对照组、病毒感染组注射等体积细胞维持液DMEM，四组均治疗21 d。放射免疫法检测治疗前后小鼠血清肝纤维化血清学指标：层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(cⅣ)、透明质酸(HA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)，小鼠肝功能：总胆红素(STB)、胆汁酸(TBA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转移酶(GGT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)，肝微粒体细胞色素P450亚型酶：CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9活性。结果经丹参酮ⅡA磺酸钠治疗21 d后，丹参酮大小剂量组LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1、STB、TBA、ALT、GGT、AST及CYP2E1、CYP3A4酶活性均有不同程度降低，与病毒感染组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，丹参酮大、小剂量组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠接种人巨细胞病毒性肝炎有明确的治疗作用，机制与其活血化瘀、降低TGF-β1、抑制小鼠肝微粒体细胞色素P450亚型酶酶活性，促进肝功能恢复有关。

[关键词]丹参酮ⅡA磺酸钠；先天性人巨细胞病毒肝炎动物模型；肝功能；转化生长因子-β1；细胞色素P450亚型酶

0引言

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)常感染肝脏、神经及血液系统，为双链线状DNA病毒，该病毒属疱疹病毒科，主要生物学特征为同期性潜伏-活动[1]。机体感染先天性人巨细胞病毒后，可出现严重的肝功能损伤，主要症状包括肝脾肿大，病理性黄疸、高胆红素血症，并最终发展为肝硬化、肝衰竭而死亡[2]。近年来临床使用丹参酮ⅡA磺酸钠防治人巨细胞病毒取得肯定的临床效果，但对其发病机制探讨有限。本研究建立小鼠先天性巨细胞病毒肝炎动物模型，深入观察丹参酮ⅡA磺酸钠治疗小鼠先天性人巨细胞病毒肝炎的效果，探讨药物保肝护肝作用机制，为其临床治疗CMV提供实验及理论基础。

1材料与方法

1.1仪器及试剂Waters 2010型高效液相色谱仪(迪马公司)；丹参酮ⅡA磺酸钠(菏泽步长制药有限公司，国药准字：Z20026866)。HCMV-AD169病毒，6.0 logTCID50/mL的病毒作为实验用毒种[3]。

1.2实验动物选择发情期SPF级Balb/c小鼠80只(雌雄各半)，10～12周龄，体重(25±5)g，动物由十堰市太和医院科研所实验动物中心提供，实验单位使用许可证编号：SYXK(鄂)2011-0031；许可证：SCXK(湘)2011-0003。动物福利：饲养环境要求动物房恒温(22 ℃，湿度1/2～75%)，单笼饲养，12 h交替光照；饲养要求满足实验动物伦理[4]，小鼠自由饮水，普通饲料喂养，观察动物饮水进食情况，称体重，及时清理粪便。

1.3小鼠先天性人巨细胞病毒肝炎动物模型参照郑意等[5]小鼠先天性人巨细胞病毒肝炎动物模型方法，小鼠按随机原则分为对照组、病毒感染组、丹参酮小剂量组、丹参酮大剂量组，每组20只(雌雄比为1∶1)，四组小鼠分组后再采用自由配对(10对)，每对雌雄鼠各1只，病毒感染组及丹参酮组分别于腹腔内接种HCMV-AD169病毒株病毒悬液1.0 mL/(6.0 logTCID50/mL)，对照组腹腔注射细胞维持液DMEM 1.0 mL/只。接种后配对饲养，观察小鼠受精并记录受精时间，待所生新生小鼠出生后第10天开始治疗，治疗前选择每对小鼠生产的新生小鼠1只(共10只)。丹参酮小剂量组按0.5 mg/(10 g·d)、丹参酮大剂量组按1 mg/(10 g·d)经腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠治疗21 d，对照组及病毒感染组注射等体积细胞维持液DMEM。

1.4检测指标参照文献[6]，经小鼠眶静脉取血0.5 mL置于肝素管，生化检测肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB。小鼠断头取肝，用GR22GⅡ型高速冷冻离心机差速离心法制备小鼠肝微粒体。先按1∶4加入匀浆缓冲液(11.5 g/L氯化钾，50 mmol/L~Tris，pH：7.4)匀浆，4 ℃下10 000转离心60 min，将离心管中沉淀组织重悬于0.25 mol/L蔗糖溶液中即获得肝微粒体，分别将各组小鼠肝微粒体标本置于-80 ℃冰箱暂存，检测时用SHA-C水浴恒温振荡器37 ℃先孵育并振荡30 min，再离心20 min后取上清液，用Waters 2010型高效液相色谱仪进样检测各组小鼠细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)酶活性。

2结果

2.1四组小鼠LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1比较病毒感染组LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1明显升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明小鼠均感染人巨细胞病毒，HCMV已垂直传播给子代小鼠。丹参酮组LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1明显降低，与病毒感染组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而丹参酮大、小剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1　四组小鼠LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1比较

2.2丹参酮ⅡA磺酸钠对肝功能的影响病毒感染组TBA、GGT、ALT、AST、STB均明显升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。经21 d治疗，病毒感染组TBA、GGT、ALT、AST、STB仍然保持在较高水平，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。丹参酮组TBA、GGT、ALT、AST、STB明显降低，与病毒感染组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而丹参酮大、小剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2　四组小鼠肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB比较

2.3丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞色素P450亚型酶活

性的影响对照组治疗前后细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)酶活性保持正常水平；病毒感染组细胞色素P450亚型酶表达均增强，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参酮大、小剂量CYP2E1、CYP3A4明显降低，与病毒感染组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，CYPIA2、CYP2D6、CYP2C9无明显变化，且丹参酮大、小剂量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞色素P450亚型酶酶活性的影响(nmol/mL)

注：与对照组比较，*P<0.05；与病毒感染组比较，#P<0.05

3讨论

丹参酮ⅡA磺酸钠(Sodium tanshinone ⅡAsulfonate，STS)是从中草药丹参中纯化分离出二萜醌类化合物，提取后经化学方法磺化而成的注射液，富含丹参酚酸、丹参酮甲酯、丹参酮ⅡA等主要有效药理成分[7]。《吴普本草》记载丹参“味辛性凉、治心肌腹痛”[8]。具有“活血通经、凉血消痈之功效”[9]。人巨细胞病毒感染机体后主要破坏肝脏组织，造成肝脏炎性改变，导致肝细胞肿胀变性、坏死，促使肝星状细胞(HSC)的激活、增殖与转化，并最终导致肝纤维化[10]，实验室检查血清肝纤维化血清学及肝功能指标常升高。由于临床药物治疗时，90%的药物由细胞色素P450亚型酶代谢，且P450的抑制与诱导均影响药物的疗效，P450活性增强常导致药物的治疗作用降低，过敏等不良反应增多[11]。LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1及TBA、GGT、ALT、AST、STB等可客观反映肝脏炎性改变及肝功能，因此，我们采用以上各指标评价丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠先天性人巨细胞病毒肝炎的治疗作用。

感染人巨细胞病毒小鼠在用丹参酮ⅡA磺酸钠治疗21 d后，肝纤维化血清学指标LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1，肝功能STB、TBA、ALT、GGT、AST，以及CYP2E1、CYP2C9酶活性均有不同程度降低。LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1等指标的下降与丹参酮ⅡA磺酸钠活血化瘀、增加肝血流量、改善肝脏组织微循环有关。有研究证实，丹参酮ⅡA磺酸钠能明显降低肝纤维化大鼠血清NO、MDA，清除机体产生过多的氧自由基，抑制脂质过氧化反应及转化生长因子TGF-β1mRNA基因表达而达到保护肝脏的作用[12]。病毒在肝脏增殖时，由于其对正常肝细胞的破坏，Na+-K+-ATP酶活性降低，细胞内能量代谢障碍，导致细胞修复能力下降。结合本实验，从电生理特点分析认为，丹参可能通过增强Na+-K+-ATP酶活性,改善肝脏组织能量代谢而起到保护作用[13]。实验中发现，丹参酮ⅡA磺酸钠具有降低细胞色素P450亚型酶CYP2E1、CYP3A4的作用，由于CYP2E1、CYP3A4与药物代谢及相互作用密切相关，其降低有利于药物的代谢并减少不良反应、增加疗效。小鼠在感染人巨细胞病毒后，其肝脏ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸环化酶活性降低，Na+-K+-ATP酶泵功能及肝脏细胞膜流动性均下降，直接导致TBA、GGT、ALT、AST、STB升高[14]。在使用丹参酮ⅡA磺酸钠治疗21 d后，TBA、GGT、ALT、AST、STB明显下降，说明其具有促进肝功能恢复的作用。

综上所述，丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠接种人巨细胞病毒性肝炎有明确的治疗作用，机制包括活血化瘀，减轻血管壁炎症反应，凉血消痈[15]，增强Na+-K+-ATP酶泵功能，促进质膜磷脂甲基化，改善微循环，增加肝脏组织供氧，抑制炎症反应造成的肝损伤而达到保护肝脏的作用。

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Experimental study of tanshinone A sulfonic acid sodium in the treatment of congenital cytomegalovirus hepatitis in miceLEI Shang-fang1,BAI Na1,BAO Sheng-juan2,LEI Shang-lin3*(1.Department of Infection of Shiyan Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Huaguo Hospital of Shiyan City,Shiyan 442000,China;3.Health Supervision Bureau in Zhangwan District,Shiyan 442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the mechanisms of sodium tanshinone A sulfonate in the treatment of animal model of murine congenital human cytomegalovirus hepatitis and to provide a theoretical basis for the treatment of congenital human cytomegalovirus hepatitis.MethodsEighty Balb/c mice (male and female) were paired and randomly divided into control group,viral infection group,small dose of tanshinone group and high dose of tanshinone group.Mice of tanshinone group were injected sodium tanshinone A sulfonate [0.5 mg/(10 g·d),1 mg/(10 g·d)] through intraperitone,and the mice of control group and infection group were injected DMEM.All the mice were treated for 21 d.The serum serologic indicators of hepatic fibrosis,such as laminin (LN),type Ⅲ procollagen (PC-Ⅲ),type Ⅳ collagen (cⅣ),hyaluronic acid (HA) and transforming growth factor-β1(TGF-β1), were measured before and after treatment by Radioimmunoassay.The indexes of liver function of mice,such as, the content of total bilirubin (STB),bile acid (TBA),alanine aminotransferase (ALT),glutamyl transferase (GGT),aspartate aminotransferase (AST) and the activity of hepatic microsomal cytochrome P450isoforms (CYP2E1,CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9),were defermined.ResultsThe content of LN,PC-Ⅲ,cⅣ,HA,TGF-β1,STB,TBA,ALT,GGT,AST,and the activity of CYP2E1 and CYP3A4 in sodium tanshinone A sulfonic group were lower than those of viral infection group at 21 d after treatment (P<0.05). There was no significant difference between the two tanshinone groups (P>0.05).ConclusionSodium tanshinone A sulfonate has definite therapeutic effect on mice inoculated with human cytomegalovirus hepatitis,and the mechanism is related to the decreased sodium tanshinone A sulfonate TGF-β1and liver microsomal cytochrome P450isoform enzyme activity.

Key words：Sodium tanshinone A sulfonate;Congenital human cytomegalovirus hepatitis animal model;Liver function;Transforming growth factor-β1;Isoform of cytochrome P450enzyme

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601003

*通信作者

收稿日期：2015-05-06