解痉止痛酊质量标准研究

崔亚玲，何　静，张朝绅，郭晓欢，马宏达



·药学研究·

解痉止痛酊质量标准研究

崔亚玲，何静，张朝绅，郭晓欢，马宏达*

[摘要]目的建立解痉止痛酊的质量标准。方法采用TLC法鉴别薄荷脑及陈皮浸出液；采用理化法鉴别水杨酸甲酯；采用HPLC法测定水杨酸甲酯的含量及辣椒浸出液中辣椒素的含量。色谱条件：①水杨酸甲酯含量测定：色谱柱为Thermo C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(60∶40)，流速为1.0 mL/min，检测波长为305 nm；柱温为25 ℃。②辣椒素含量测定：色谱柱为Welchrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(45∶55)，流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm；柱温为25 ℃。结果薄层定性鉴别斑点清晰，分离效果良好，专属性强；理化鉴别反应灵敏，阴性对照无干扰。水杨酸甲酯含量在0.13~2.60 μg范围内线性关系良好(r=1.000 0)，平均加样回收率为99.50%，RSD为0.43%(n=6)。辣椒素在0.091~2.912 μg范围内线性关系良好(r=1.000 0)，平均加样回收率为101.06%，RSD为1.45%(n=6)。结论本方法结果准确、操作简单，专属性和重复性良好，可作为该制剂的质量控制标准。

[关键词]解痉止痛酊；质量标准；高效液相色谱法；薄层色谱法

0引言

解痉止痛酊是中国人民解放军第四六三医院生产的医院制剂，由辣椒、陈皮、薄荷脑及水杨酸甲酯组成。具有活血通经、止痛等功效。主要用于治疗软组织损伤引起的颈、肩、腰、腿痛，对冻疮也有一定疗效，质量稳定，在临床有很大的需求。目前解痉止痛酊制剂质量标准不够完善，为了控制该制剂的质量，保证临床用药合理安全[1]，本研究采用TLC法对制剂中薄荷脑和陈皮浸出液进行定性鉴别，采用理化法对水杨酸甲酯进行定性鉴别。并以水杨酸甲酯作为指标，采用HPLC法测定本品中水杨酸甲酯含量，同时以辣椒素作为指标，采用HPLC法测定中间品辣椒浸出液中辣椒素的含量，方法快速简便、灵敏度高，可作为该制剂的质控标准。

1仪器与试药

高效液相色谱仪(配备W600型泵，2996型紫外检测器，Waters公司)；电子分析天平(120D型，北京岛津公司)；微量定量点样管(北京先驱威锋技术开发公司)；薄荷脑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110728-200506)；橙皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110721-201316)；水杨酸甲酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110707-201413)；辣椒素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110839-201205)；薄层层析硅胶G(化学纯，青岛海洋化工有限公司)；解痉止痛酊(中国人民解放军第四六三医院，批号：20141013、20150317、20150423)；陈皮浸出液(中国人民解放军第四六三医院，批号：20141011、20150315、20150421)；辣椒浸出液(中国人民解放军第四六三医院，批号：20141011、20150315、20150421)；甲醇(色谱纯，Sigma公司)，乙腈(色谱纯，Sigma公司)，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1薄荷脑薄层鉴别[2]取本品5 mL，作为供试品溶液。按处方配比，取除薄荷脑外的其他药材，按制备工艺制成酊剂，取5 mL作为阴性对照溶液。另取薄荷脑对照品加乙醇制成1 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，分别吸取5 μL上述3种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯(19∶1)，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液。在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照不干扰薄荷脑薄层鉴别。3批样品的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。

图1　薄荷脑薄层色谱鉴别

3.供试品3(批号：20150423)，4.薄荷脑对照品(中检所，批号：110728-200506)，5.薄荷脑阴性样品

2.2陈皮浸出液薄层鉴别[3-5]取陈皮浸出液5 mL，作为供试品溶液。按处方配比，取除陈皮浸出液外的其他药材，按制备工艺制成酊剂，取5 mL作为阴性对照溶液。另取橙皮苷对照品加甲醇制成1 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，分别吸取5 μL上述3种溶液点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为二氯甲烷-甲醇-水(32∶17∶5)的下层溶液，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝甲醇试液，在105 ℃加热2~3 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品不干扰陈皮薄层鉴别。3批样品的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2。

图2　陈皮浸出液薄层色谱鉴别

批号：110721-201316)，2.供试品1(批号：20141011)，3.供试品2(批号：20150315)，4.供试品3(批号：20150421)，5.阴性样品

2.3水杨酸甲酯理化鉴别取本品5 mL置试管中，按处方配比，取除水杨酸甲酯外的其他药材，按制备工艺制成酊剂，取5 mL作为阴性样品溶液。加水3 mL摇匀，下层显鲜红色。弃去上层液后，加三氯化铁饱和溶液1滴，显紫色。再加水5 mL下层显红色，上层显紫色，阴性样品无干扰(图3)。3批样品的供试品均显相同颜色的反应(图4)。

2.4含量测定

2.4.1水杨酸甲酯含量测定[6-8]①色谱条件。色谱柱：Thermo C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：305 nm；进样量：20 μL。②对照

图3　水杨酸甲酯专属性理化鉴别

图4　水杨酸甲酯重复性理化鉴别

批号：20150317)，3.供试品溶液3(批号：20150423)

品溶液的配制：精密称定水杨酸甲酯对照品适量，加甲醇使溶解，制成浓度为65 μg/mL的溶液，即得。③供试品溶液的配制：精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。④阴性样品溶液的制备：按处方取除水杨酸甲酯外的各味药材，按制备工艺制得样品，再按“2.4.1”项供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。色谱图见图5。⑤标准曲线的制备：精密吸取浓度为65 μg/mL的水杨酸甲酯对照品溶液各2、5、10、20、40 μL，注入液相色谱仪，按“2.4.1”项色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标、峰面积值为纵坐标，求得回归方程：y=1 645 414.42 x-34 136.17，r=1.000 0。结果表明，水杨酸甲酯在0.13~2.60 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。⑥精密度试验：精密吸取浓度为65 μg/mL的水杨酸甲酯对照品溶液20 μL，按“2.4.1”项色谱条件分析，连续进样6次，记录各色谱峰的峰面积，测得峰面积值的RSD为0.24%(n=6)，符合要求。⑦稳定性试验：取同一批(批号：20141013)样品，按照“2.4.1”项供试品溶液制备方法和色谱条件进行分析，分别在0、3、6、9、12、15 h测定样品中水杨酸甲酯峰面积，测得峰面积值的RSD为0.10%(n=6)，表明供试品溶液在15 h内稳定。⑧重复性试验：取同一批(批号：20141013)样品，按照“2.4.1”项供试品溶液制备方法和色谱条件进行分析，测定每份样品中水杨酸甲酯含量。结果样品中水杨酸甲酯平均标示量为101.06%，RSD为0.68%(n=6)，符合要求。⑨加样回收率试验及样品测定：取同一批(批号：20141013)样品，精密量取0.5 mL，分别加入水杨酸甲酯对照品溶液(108.553 mg/mL)各1 mL，再按照“2.4.1”项供试品溶液制备操作，制成回收率用供试品溶液，按“2.4.1”项色谱条件分析，测定样品中含量，计算回收率，结果平均回收率为99.50%，RSD为0.43%(n=6)，符合要求。结果见表1。取3个批号的样品，按照“2.4.1”项供试品溶液制备操作，按“2.4.1”项色谱条件测定各自样品中水杨酸甲酯的含量。结果见表2。

表1　回收率试验

图5　水杨酸甲酯HPLC色谱图

批号称样量(mL)标示量(%)平均值(%)20141013199.72100.531101.3320150317197.4996.95196.40201504231100.06100.471100.87

2.4.2辣椒浸出液含量测定[9-11]①色谱条件：色谱柱：Welchrom C18(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(45∶55)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL。②对照品溶液的配制：精密称定辣椒素对照品适量，加甲醇制成浓度为45 μg/mL的溶液，即得。③供试品溶液的配制：精密量取辣椒浸出液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱图见图6。④标准曲线的制备：精密吸取浓度为45.5 μg/mL的辣椒素对照品溶液各2、4、8、16、32、64 μL，注入液相色谱仪，按“2.4.2”项色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标、峰面积值为纵坐标，求得回归方程：y=734 385.03 x-15 994.56，r=1.000 0。结果表明，辣椒素在0.091~2.912 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。⑤精密度试验：精密吸取浓度为45.5 μg/mL的辣椒素对照品溶液20 μL，按“2.4.2”项色谱条件分析，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，测得峰面积值的RSD为0.60%(n=6)，符合要求。⑥稳定性试验：取同一批样品(批号：20141011)，按照“2.4.2”项供试品溶液制

图6　供试品和辣椒素对照品色谱图

备方法和色谱条件进行分析，分别在0、2、4、6、8、10 h，测定样品中辣椒素峰面积，测得峰面积值的RSD为1.55%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。⑦重复性试验：取同一批样品(批号：20141011)，按照“2.4.2”项供试品溶液制备方法和色谱条件进行分析，测定每份样品中辣椒素含量。结果样品中辣椒素平均含量为0.206 7 mg/mL，RSD为1.61%(n=6)，符合要求。⑧加样回收率试验：取同一批样品(批号：20141011)，精密量取1 mL，分别加入辣椒素对照品溶液(100 μg/mL)各2.5 mL，按照“2.4.2”项供试品溶液制备操作，制成回收率用供试品溶液，再按“2.4.2”项色谱条件进行分析，测定样品中含量，计算回收率，结果平均回收率为101.06%，RSD为1.45% (n=6)，符合要求。结果见表3。⑨样品的测定：取3个批号的辣椒浸出液，按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，按“2.4.2”色谱条件测定各自样品中辣椒素的含量。结果见表4。

3讨论

3.1定性鉴别的优化采用薄层色谱法鉴别陈皮浸出液时，笔者曾尝试按照2010年版《中国药典》一部中陈皮鉴别方法进行试验，但试验结果显示其Rf值在0.1左右，Rf值偏低，故考察了不同展开剂比例来增大Rf值，但此展开系统较复杂，且为二次展开，Rf值变化不大，故查阅文献更换鉴别方法。实验结果表明，更换后的方法专属性及重复性良好，Rf值在0.2~0.8范围内，且展开条件简单，选取更改后的方法作为陈皮浸出液的鉴别方法。

表3　回收率试验

表4　三批中间品含量测定结果(n=2)

3.2在水杨酸甲酯含量测定中，分别考察了乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(60∶40)流动相系统。以乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(60∶40)为流动相时，分离度均>1.5，水杨酸甲酯分离效果较好，但以乙腈-水(65∶35)和甲醇-水(80∶20)为流动相时，前者保留时间较长而后者保留时间太短；而以甲醇-水(60∶40)为流动相时，峰形较好，无阴性干扰，且保留时间合适，故选择以甲醇-水(60∶40)为流动相。

3.3在辣椒浸出液的含量测定中，分别考察了甲醇-水(50∶50)、乙腈-水(40∶60)、乙腈-水(45∶55)流动相系统。以甲醇-水(50∶50)为流动相时，辣椒素未出峰。以乙腈-水(40∶60)、乙腈-水(45∶55)为流动相时，分离度均>1.5，辣椒素分离效果较好，但以乙腈-水(40∶60)为流动相时，辣椒素保留时间较长；而以乙腈-水(45∶55)为流动相时，峰形较好，且保留时间适宜，故选择以乙腈-水(45∶55)为流动相。

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Study on quality standard of jiejing zhitong tinctureCUI Ya-ling,HE Jing,ZHANG Chao-shen,GUO Xiao-huan,MA Hong-da*(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Command Area,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish and consummate a quality control for jiejing zhitong tincture.MethodsThin-layer chromatography was used for the identification of leaching solution of pericarpium citri retculatae and menthol. The methyl salicylate was identified by physicochemical method. High performance liquid chromatography was used for the determination of methyl salicylate in jiejing zhitong tincture and capsaicin in pepper extract. The chromatography condition of methyl salicylate was performed on Thermo C18(4.6 mm×150 mm，5 μm),the mobile phase consisted of methanol-water(60∶40)with the flow rate of 1.0 mL/min,the detection wavelength was 305 nm,column temperature was 25 ℃. The condition of capsaicin’s determination was performed on Welchrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm) with acetonitrile-water (45∶55) as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 280 nm,column temperature was 25 ℃. ResultsThe spots in the thin layer chromatography were clear. Methyl salicylate was sensitive to the physicochemical method. The linear range of methyl salicylate was 0.13~2.60 μg (r=1.000 0). The average recovery was 99.50% (RSD=0.43%,n=6). The linear range of capsaicin was 0.091~2.912 μg ( r=1.000 0). The average recovery was 101.06% (RSD=1.45%,n=6). ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,which can be used for quality control of jiejing zhitong tincture.

Key words：Jiejing zhitong tincture;Quality standard;HPLC;TLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601017

*通信作者

基金项目：军队医疗机构制剂标准提高科研专项面上课题

收稿日期：2015-07-15

作者单位：沈阳军区总医院药剂科，沈阳 110016

(14ZJZ13-1)