人狂犬病病例的实验室诊断技术及应用原则

种世桂，赵玉敏

（桂林医学院，广西 桂林 541004）

人狂犬病病例的实验室诊断技术及应用原则

种世桂，赵玉敏

（桂林医学院，广西 桂林 541004）

我国是狂犬病疫情最严重的地区之一，在世界范围内年报告死亡人数仅次于印度。虽然近年狂犬病报告病例数逐年下降，但疫区不断扩大。我国的人狂犬病病例报告大部分基于临床症状及病例的流行病史，基于实验室诊断报告的病例为数甚少。而WHO要求狂犬病病例报告具有实验室诊断依据；国家新的监测方案也要求所有报告病例均应进行实验室检测。基于以上背景，本文着重对人狂犬病病例的实验室诊断技术及其应用原则进行综述，以期为我国今后狂犬病病例的监测及实验室诊断提供借鉴。

人狂犬病病例；狂犬病；狂犬病毒；实验室诊断

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染引起的人兽共患烈性传染病，属于中华人民共和国乙类法定报告传染病，病死率将近100%。我国狂犬病病例大多是依据动物咬伤史和典型的临床表现而确定的临床诊断病例，实验室诊断病例相当有限。随着循证医学的发展，实验室诊断的地位日益突出。一方面，狂犬病潜伏期长短的不确定（几周到几年不等）、与其他脑炎在临床表现上具有相似性，极易误诊或漏诊。另一方面，按照WHO对于疾病诊断的要求，狂犬病病例的诊断除传统的由症状、病史作出临床诊断外，其确诊更应依赖于实验室进行的病原学诊断，以及时正确进行暴露后患者的针对性处理及带毒动物的处置，避免狂犬病的进一步播散。因此，在条件允许的情况下，所有可能或者疑似的临床狂犬病病例都要用实验室方法进行确诊。本文主要介绍了目前应用于人狂犬病例诊断的实验室诊断方法及其应用原则，并比较了各自的优缺点，为人狂犬病病例的早期诊断和深入研究以及进一步的预防和控制提供理论基础。

1　狂犬病病例的诊断

根据《狂犬病诊断标准（WS281-2008）》，同时参考世界卫生组织《狂犬病咨询报告（第二版）》中实验室检测方法，临床诊断为脑炎的病例都要引起警觉；若条件允许，所有狂犬病可疑病例都要用实验室方法进行证实。狂犬病的临床定义：病例具有急性神经综合症 （如脑炎），主要表现为过动综合征（如狂躁型狂犬病）或者麻痹综合征（如早瘫性狂犬病），渐渐发展为昏迷或死亡。如果没有重症监护，病人通常会在首发症状出现后7～11d内死于循环或呼吸衰竭［1］。

2　人狂犬病实验室诊断技术

狂犬病病毒的特异性检测是确诊的必要条件，建立并普及特异性检测技术对该病是预防和诊治都有重要意义。狂犬病病毒包涵体的特异性不强，与其它疾病易于混淆，通过观察中枢神经系统神经元胞浆内的包涵体、内基式小体的组织病理学方法已经很少在世界各地应用。目前我国狂犬病例实验室诊断常用的技术包括DFA、RFFIT、RT-PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等等。

2.1荧光抗体试验（FluorescentAntibody Test，FAT）

荧光抗体试验（FAT）［2］是通过狂犬病病毒抗原的单克隆抗体或者多克隆抗体来检测样本中狂犬病病毒的方法。DFA是狂犬病毒抗原检测的金标准，是狂犬病实验室诊断最快速、最可靠的方法［3］，其原理为：感染狂犬病毒的细胞携带的狂犬病毒抗原，可以特异性地与FITC标记的抗狂犬病毒单克隆抗体相结合，在显微镜下可以直接观察到的FITC的可见荧光了解到抗原抗体之间的特异性反应。阳性结果表明狂犬病毒感染，有确诊意义［4］。该法可检测新鲜病料、甲醛固定的标本或甘油保存的样品，也可检测临床狂犬病人的皮肤活检物或毛囊，甚至是冰冻几小时内的皮肤活组织或角膜印片中的病毒抗原［5］。

2.2酶联免疫吸附试验（enzyme1inkedimmunosorbentassay，ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）主要根据抗原抗体结合反应实现检测目标，不仅能评估动物免疫水平，还可用于检测脑组织中狂犬病病毒核衣壳蛋白。应用在狂犬病的诊断方面主要依赖狂犬病毒抗原进行，ELISA检测狂犬病抗原是PerrinP于1986年建立的，通过使用抗狂犬病毒特异性单克隆抗体包被塑料板，与标本中的待检抗原结合，其中待检抗原又与后加入的辣根过氧化物酶标记抗狂犬病毒单克隆抗体特异性结合，再通过辣根过氧化物酶与底物作用产生可见的颜色反应，最终达到检测目的。其显色程度与待检抗原含量呈正相关［4］。

2.3快速狂犬病酶免疫诊断法（rapidrabiesenzy meimmunodiagnosis，RREID）

快速狂犬病酶免疫诊断法（RREID）是一种简单的常规诊断狂犬病的快速酶免疫诊断技术，也是WHO推荐的抗原检测方法，通过检测脑组织中的狂犬病病毒核蛋白来诊断狂犬病。

2.4快速荧光灶抑制试验（rapid fluorescentfocus inhibition test，RFFIT）

快速荧光灶抑制试验（RFFIT）是WHO狂犬病专家委员会推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法［1］，是以荧光灶为指示系统的血清中和试验。通过将待测血清与攻击病毒进行中和反应后，接种体外细胞，用荧光抗体试验（FAT）检测剩余病毒从而计算中和抗体效价［2，15，16］。试验中应尽量减小样品的污染；冷丙酮固定-20℃较-4℃效果要好，固定时间应大于10min，最好能达到半个小时；试验完成后尽快镜检以防荧光信号淬灭影响结果。RFFIT可以在24h内检测出抗体水平，除了应用于狂犬病疫苗接种者血清中和抗体水平检测外，还可应用于动物接种试验、细胞培养基础上的中和试验、抗狂犬病病毒糖蛋白抗体检测试剂盒的评估、中和性单克隆抗体的鉴定和评价以及被动免疫制剂的效能评估等方面。RFFIT实验步骤繁琐，实验试剂及仪器要求较高，对实验操作人员要求高，其检测结果受到操作人员的熟练程度及主观判定因素、病毒种子的质量、标准血清和样品的质量、抗体浓度以及实验对照系统情况等因素影响。

2.5荧光抗体病毒中和试验（fluorescentantibody virus neutralization test，FAVNT）

荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）是OIE认定的狂犬病抗体检测标准方法，目前在WHO和OIE狂犬病参考实验室中应用较广［21］。FAVNT也是一种抗原抗体中和反应试验方法，将一定量的血清与狂犬病毒CVS（适应细胞培养的标准攻毒毒株）在体外中和，然后接种对狂犬病病毒敏感的细胞，血清稀释度能100%中和病毒，且当血清滴度在50%以上就有中和病毒的能力。该试验对血清质量要求较高，细胞对毒素太敏感，血清内所含毒素较多可导致假阳性的发生。FAVNT敏感性、特异性强，可进行较大样本的检测，但其操作过程较复杂，所需时间较长（至少一天），通常仅作为辅助诊断方法而不作为常规方法。

2.6PCR（Polymerse Chain Reaction，PCR）检测技术

聚合酶链反应（PCR）是1983年Millis发明的一种核酸体外扩增系统，以双链DNA分子碱基配对为原则，采用耐热DNA聚合酶和DNA合成引物，以目的基因为模板在体外特异性扩增DNA片段。PCR技术灵敏度高、诊断快速，适用于大批量样品的狂犬病毒毒株核酸检测，还可用于唾液、脑脊液等不适合做DFA的标本。但其对试验条件、实验设备、操作人员的要求相当严苛，极易造成假阳性或者假阴性。目前，狂犬病病毒核酸的检测技术只作为狂犬病诊断技术的辅助性或确定性方法。

2.6.1逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR扩增前需要先完成逆转录、合成第一条cDNA链（RT）再进行PCR扩增，即逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerasechainreaction，RT-PCR）。基于这一原理，设计狂犬病毒基因片段特异性扩增引物，将可疑狂犬病人的标本进行核酸提取、特异性扩增和检测，阳性结果可以明确狂犬病毒感染，确诊狂犬病［4］。

2.6.2巢式PCR（nested-PCR）

巢式PCR（nested-PCR）是由普通PCR发展而来的一种PCR技术，是一种常用的检测狂犬病病毒的分子生物学方法。其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。诊断狂犬病可以通过核苷酸序列测定、RT-PCR产物的多态性分析，或者针对各基因型设计特异性引物进行巢式PCR实现。巢式PCR的灵敏度和特异性比RT-PCR更好，也可作为狂犬病实验室诊断技术之一。

2.6.3实时荧光定量PCR（Real-TimePCRor qRT-PCR）

实时荧光定量PCR是一种由PCR技术发展而来的检测技术，在反应体系中加入荧光染料或荧光探针等荧光物质，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知起始模板定量分析的方法。该技术实行完全闭管式操作，大大减少扩增产物污染的机会，还具有操作简单、快速高效、灵敏度高、特异性强、动力学范围宽及高通量等优点，极大地克服了原有PCR技术的不足，广泛应用于核酸定量分析中。但由于该技术成本较高，在大部分实验开展比较困难，短期内难以普及。

3　狂犬病病例实验室诊断的关键步骤

3.1狂犬病实验室诊断的生物安全

在狂犬病相关工作中，安全至关重要。所有狂犬病诊断及相关工作的参与人员均应事先接种狂犬疫苗并证实已获得完全性保护 （血清抗体≥0.5IU/mL）。通常，对动物处理、尸体解剖、收集准备品、样本处理等常规的实验室活动应在生物安全II级实验室完成。在某些情况下，如生产大量浓缩病毒、进行会产生气溶胶的操作（例如同质化的组织悬液）、不清楚当前的预防措施对所接触的狂犬病病毒防护效果如何，可考虑采用生物安全III级实验室。应该遵守所有涉及感染性物质工作的国家安全指南。

3　结论与展望

随着诊断技术的不断发展进步，我国报告法定传染病的实验室诊断率不断提高，但仍远远落后于西方国家的实验室诊断率。不同的可疑狂犬病病料需要恰当的实验室方法才能明确诊断。规范化的诊断程序在狂犬病例确诊上具有极其重要的作用；快速准确得出狂犬病实验室诊断结果对病人的暴露后治疗、受暴露驯养动物的预防处置至关重要。狂犬病实验室诊断技术的进一步推广，我国狂犬病实验室诊断率的提高，适用于野外和实验室操作的简单、特异且敏感的病毒抗原检测、血清抗体监测及病毒核酸检测的方法等等，都有待进一步研究。

［1］ WHO expert consultation on rabies.Second report.World Health Organ Tech Rep Ser.2013，（982）：1-139.

［2］ 扈荣良.狂犬病理论、技术与防治［M］.北京：科学出版社，2007.

［3］ Meslin F X，Kaplan M M，Koprowski H.Laboratory techniques in rabies，Fourth edition，WHO，Geneva，1996，88-95.

［4］ 中华人民共和国卫生行业标准：狂犬病诊断标准（WS2 81-2008）［M］.北京：人民卫生出版社，2008.

［5］ 李静.狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中应用的研究［D］.泸州医学院，四川：2009.

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