国家重点研发计划《新一代高通量数字PCR关键技术及应用研究》简介

兰英 杜文斌 中国科学院微生物研究所，微生物资源前期开发国家重点实验室

国家重点研发计划《新一代高通量数字PCR关键技术及应用研究》简介

兰英 杜文斌 中国科学院微生物研究所，微生物资源前期开发国家重点实验室

数字PCR（digital PCR，dPCR）技术是继实时荧光PCR（qPCR）之后的第三代定量核酸检测技术[1]，可实现对核酸样本的数字化绝对定量分析，突破了传统PCR检测在区分较小的拷贝数差异的局限，从而在低频核酸突变检测等领域具有革命性的优势。数字PCR的基本原理是：将稀释的核酸样品分配到大量独立的微反应单元，进行大规模单拷贝PCR扩增反应和基于泊松分布（Poisson distribution）的绝对定量分析。简单来说，数字PCR通过对海量微反应单元的荧光信号进行读取分析，可直接数出核酸分子的个数。与实时荧光定量PCR相比，数字PCR具有很强的抗干扰能力和对多基因靶点的同时检测能力，具有极高的定量精确性和灵敏度，在区分等位基因的差异性表达水平、检测病毒感染载量、肺癌突变基因靶向分析以及检测孕妇外周血中胎儿游离DNA等方面有广阔的应用潜力。

表1. 市场上数字PCR相关仪器比较

近年来，随着微纳加工及微流控技术的发展，使高通量的皮纳升体积单拷贝反应单元的快速生成、均一扩增条件控制和高通量检测成为可能，这为数字PCR装备的研发带来了契机。目前主要的数字PCR技术可归纳为三种类型：（1）大规模集成流路技术（Integrated fuidic circuits，IFCs）：利用多层软光刻工艺在聚二甲氧基硅烷（PDMS）上加工带控制阀门的微管和微腔体，实现生物样品的分液、混合、及PCR扩增。2006年美国 Fluidigm公司推出的首台商品化数字PCR仪Bio-Mark便基于IFCs技术；（2）开放微孔阵列技术（Open Arrays）：在疏水基片上微加工开口的纳升体积微孔阵列，利用微孔的亲水化处理，通过点样或浸泡等方法引入纳升PCR反应体系，进行大规模阵列反应。如美国Life Technologies于2014年推出的QuantStudio 3D 数字PCR系统；（3）微滴微流控技术(droplet microfluidics)：利用微流控通道生成油包水微滴进行数字PCR扩增和分析。如2013年美国伯乐公司（Bio-Rad）推出的QX200 数字PCR仪，以及RainDance公司推出的Raindrop 数字PCR仪（见表1）。目前，国外数字PCR设备已经有近10年的商业化进程，并且已经全面进入中国市场。主流进口数字PCR仪器单价在百万元人民币左右，配套的耗材如芯片、试剂等价格不菲。短短几年时间内，众多国外知名仪器厂商相继推出数字PCR设备，数字PCR仪的研发无疑是当前分子诊断装备领域的一个发展热点，具有非常广阔的市场前景。

数字PCR核酸分析相关技术研究最近几年得到了国内科研单位和相关企业广泛的关注，有不少国内研究机构在开展相关工作[2]。如浙江大学[2]、北京大学[4]、中科院上海微系统与信息技术研究所[5]、中科院半导体研究所[6]等单位也都在数字分子诊断微流控技术领域开展了高水平的工作。未来5～10年，是数字PCR临床诊断应用推广的关键时期。因此，我们认为在基础研究之外，急需加快我国自主知识产权数字PCR商品化设备的研发，避免在数字PCR技术临床市场打开后，出现类似实时荧光PCR设备严重依赖进口的局面。

为了在技术和仪器研发等落后的条件下寻求突破，本项目集合了中国科学院微生物研究所、上海交通大学、东南大学和北京华金瑞清生物医药技术有限公司等单位的优势力量，研究的目标是：针对现有数字PCR技术的瓶颈和不足，研发面向复杂临床样品的高通量自动化磁分离定量核酸提取技术，并利用独创的具有自主知识产权的动态界面打印微滴阵列制备技术，实现低成本、高通量的微滴反应单元阵列的制备以及大规模微滴阵列的实时荧光动态成像检测，研究开发新一代高通量数字PCR装备。项目下设四个课题，包括东南大学孙岳明教授的《自动核酸提取和高通量微滴阵列制备关键技术开发》，上海交通大学电子信息与电气工程学院陈迪教授的《大面积精确温控模块及核酸扩增芯片关键技术研究》，上海交通大学电子信息与电气工程学院刘满华副教授的《高通量实时图像采集、处理与分析与算法研究和软件开发》，以及中国科学院微生物研究所杜文斌研究员的《高通量数字 PCR 关键技术集成样机开发与临床验证》。项目具体研究包括：

（1）针对临床样品分析，开发基于自动化磁分离的高通量阵列核酸提取技术。

数字PCR的定量精确性依赖于标准化的定量核酸提取技术的支撑。目前临床诊断的生物样品复杂的处理和制备过程，不仅耗时耗力，且使数字PCR的精确定量的可靠性因为核酸提取过程中的损失和污染而丧失。因此，本项目提出 “样本提取—扩增制备—定量分析”全过程自动化和标准化操作的新思路。研究团队东南大学在功能化纳米磁性颗粒核酸纯化方面具有丰富的前期积累，可以很好地实现从样本中提取高质量的核酸样本。

（2）开发更加简便和集成化的微体积反应单元制备技术。现有微流控微滴生成技术依赖于昂贵的微加工芯片耗材，加工成本高，相关工艺的国产化尚未成熟。本研究团队前期开发了新型动态界面打印均一微滴阵列制备技术7，可在96孔板上通过低成本的探针式打印耗材，不仅大大降低耗材开发的难度，降低成本，而且可以利用探针的二维阵列，实现大批量样品的微滴阵列制备。

（3）大规模微滴阵列PCR温控芯片系统和实时荧光动态成像系统的全新设计。

从阵列式设计出发，利用微滴的自动阵列排布、高精度的大面积半导体温控以及基于自适应阈值的微滴图像快速自动提取和轨迹跟踪分析模型算法，提高数字PCR的平行样品处理通量，并提供更加准确的数字PCR扩增结果分析。

通过以上关键技术开发以及样机的研制，项目组将力争早日开发出适合临床应用需求的国产数字PCR装备。同时，项目组也高度重视与相关企业以及医疗机构的合作，希望能够通过临床应用来检验系统的可靠性、实用性和稳定性。相信通过本装备项目的实施，以及国内数字PCR技术领域专家的共同努力，能够为国产数字PCR仪器的商品化开发打下坚实的基础。在不远的将来，希望国产化数字PCR仪能够走进广大基层医院和检验机构，在实现疾病的诊断和病情的监控、指导个体化治疗，尤其是病毒和细菌感染性疾病的诊断、优生优育、遗传病筛查、肿瘤早期诊断等方面发挥巨大作用，为提升全社会的健康水平做出重大贡献。

[1] Baker, M. Nat. Methods 2012, 9, 541-544.

[2] Ding, X.; Mu, Y. Chinese J. Anal. Chem. 2016, 44, 512-521.

[3] Zhu, Q.; Qiu, L.; Yu, B.; Xu, Y.; Gao, Y.; Pan, T.; Tian, Q.; Song, Q.; Jin, W.; Jin, Q.; Mu, Y. Lab Chip 2014, 14, 1176-1185.

[4] Men, Y.; Fu, Y.; Chen, Z.; Sims, P. A.; Greenleaf, W. J.; Huang, Y. Anal. Chem. 2012, 84, 4262-4266.

[5] Bian, X.; Jing, F.; Li, G.; Fan, X.; Jia, C.; Zhou, H.; Jin, Q.; Zhao, J. Biosens. Bioelectron. 2015, 74, 770-777.

[6] Li, Z.; Liu, Y.; Wei, Q.; Liu, Y.; Liu, W.; Zhang, X.; Yu, Y. PLoS One 2016, 11, e153359.

[7] Xu, P.; Zheng, X.; Tao, Y.; Du, W. Anal. Chem. 2016, 88, 3171-3177.