化学品急性毒性藻红外测试技术的方法改进研究

郭蔚华，李星广，林艳，杨鹏飞

重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045

化学品急性毒性藻红外测试技术的方法改进研究

郭蔚华*，李星广，林艳，杨鹏飞

重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045

在以往藻红外测试技术的急性毒性测试中，每次每个测试杯测试1个藻温，共2个测试组，并用藻最大响应温差1个指标进行毒性评价，测试结果的可行性和稳定性不理想，针对这个问题提出了改进方法：1)每次每个测试杯连测3个藻温；2)改为3个测试组；3)将单指标法改为三指标法；4)增加测试结果的重现性分析。通过蒸馏水毒性测试实验和重金属毒性测试实验，分析改进方法的效果。结果显示，不同指标方法中，三指标法控制假结果出现率为20%，控制效果最好；在测试4元重金属共存(总浓度0.066～0.156 mg·L-1)的毒性时，测试3个藻温的所有指标法的平均重现率(%)/重现性(%)均为100%/100%，测试1个藻温的三指标法的平均重现率(%)/重现性(%)为67%/100%，表明测试高浓度的重金属毒性时，不同指标法都有很好的评价效果；在测试一元重金属(0.001～0.1 mg·L-1)毒性时，只有三指标法的平均重现率(%)/重现性(%)是100%/100%，远高于其他指标法，表明只有三指标法才可准确测试低浓度重金属的毒性。在测试5种不同重金属共存的毒性时，三指标法的平均重现率(%)/重现性(%)平均为86.8%/100%。研究表明，改进后的技术用于化学品急性毒性测试，灵敏度高和稳定性好，结果可靠。

化学品；藻红外测试；三指标法；技术改进

Received 24 March 2016 accepted 18 July 2016

化学品急性毒性藻红外测试技术测试原理为藻类细胞具有光合磷酸化和氧化磷酸化的2套能量代谢系统，毒物作用前后藻代谢能量会产生微量变化，这种微能量变化可被红外测温仪测试，对测试藻温进行处理便能分析藻对毒物的响应。该技术具有快速、简便、价廉、可现场测试等特点[1-4]，然而，该技术一直存在4个问题：一是未考虑红外测温仪测试的末位藻温波动性，每次每个测试杯只测1个藻温，与波动藻温平均值的偏差较大；二是未考虑到2个测试杯的藻温之差伴随整个测温过程，在毒性测试藻响应温差时未减去；三是用加药组和对照组只能得到1种藻温差，不能对藻温差比较分析；四是只用了藻响应温差这一个指标分析藻对毒物的响应，效果较差。这4个问题的存在，使技术测试毒物毒性的性能较低，需要改进技术。拟定改进方案为：每次每个测试杯连测3个藻温，取其平均值，以解决仪器测试藻温的波动性；用空白组、对照组、加药组的3个测试组，解决只能得到一种藻温差的问题；用三指标(最大藻温差比较值、平均藻温差比较值、藻响应率)的分析法分析藻对毒物的响应，降低分析结果的偶然性；增加测试结果的重现性，保证测试结果的可靠性。藻红外测试技术是用红外测温仪测试毒物作用前后藻能量的微变化，属微量定性测试，因仪器较敏感，用控制假结果出现率作为检验技术的唯一标准，用重现性分析改进技术的稳定性。目前，国内外关于急性毒性的单细胞微生物测试法改进的研究报道主要有发光细菌生物毒性测试方法的改进[5]、发光细菌毒性测试条件的优化[6]、发光细菌急性毒性测试方法的优化[7]、水质急性毒性发光细菌测试法的改进[8]；对测试水质发光细菌的菌种进行改进[9]、Menz等[10]对发光细菌法进行改进，引入自动化的概念。关于藻红外测试的研究涉及敏感藻的确定方法[4]、重金属[11]、农药[12]、其他有毒有害有机物[13]急性毒性藻红外测试、急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法[14]、藻红外测试多元有机毒物急性毒性的初步分析[15]、急性毒性藻红外测试中联合作用评价法的重现性[16]等，有关技术改进方法研究尚未见报道。为此，笔者进行了藻红外测试分析法改进的研究。

将通过蒸馏水毒性测试的检验实验和重金属毒性实测实验，分析改进方法对藻响应率与假结果出现率控制的关系和重金属毒性实测的效果等，确定改进后藻红外测试技术的可行性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

藻种：滇池铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake in China)，及其培养基配方由中国科学院武汉水生生物研究所提供。该藻具有春化作用[17-18]，为滇池水华藻种，生长快、饱和密度高，可保证实验所需的藻密度和藻用量。

药品：国产分析纯ZnCl2、Pb(NO3)2、CuSO4、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4、AlCl3·6H2O、Cd(NO3)2·4H2O，均购自成都科龙化工试剂公司，上述试剂均配制成0.1 mgL-1的母液备用。

药液配制：采用母液配制实验溶液，取适量药液加入5 mL藻液中，使藻液中各重金属浓度等于《生活饮用水卫生标准》GB5749-2006中对应的毒理学指标的重金属浓度(见表4)。藻液中重金属浓度计算公式如下。

N=M÷(1000×D)×A×1000÷V

仪器：ST60红外测温仪(灵敏度0.1 ℃)，购自福禄克测试仪器(上海)有限公司；LRH-250A生化培养箱(灵敏度±0.2 ℃)，购自广州沪瑞明仪器有限公司；MOTICBA200数码显微镜，购自北京翔天智远科技有限公司；HETTICH-EBA离心机，购自德祥科技有限公司；DR/4000U分光光度计，购自德祥科技有限公司。

测试杯：直径4 cm、高3 cm、厚0.1～0.2 cm的透明塑料容器。

1.2 实验方法

1.2.1 藻温测试方法

藻温测试在室内条件下进行，采用散射日光或灯光采光。实验的藻液用量为5 mL/杯，藻密度≥3.16×109个/L；测试杯加藻液前，藻液充分摇均；当培养期间藻增长率≤0时，藻液不再用于实验。滴加药液前，药液充分摇匀。

当测试杯放置好后(布局见图1)，每个测试杯中加入5 mL藻液，进行加药前测温记录，每次每杯连测3个藻温。然后，滴加药液，蒸馏水毒性测试时用滴液管分别滴加蒸馏水1滴(约0.05 mL)于加药组、对照组的测试杯中，重金属毒性测试时用滴液管分别滴加药液、蒸馏水各1滴于加药组、对照组的测试杯中，立即进行加药后的测温记录，每次每杯连测3个藻温。测温时，红外测温仪头部距离藻液正上方10～15 cm，指示红色光点对准藻液面中心时测温。测温顺序：从上到下，从左到右。药液滴入藻液后到藻产生响应需要一定时间，藻对不同药液的响应过程不同，加药前测温1遍，加药后测温10遍。

图1 重金属急性毒性藻红外测试法中测试杯布局图Fig. 1 Arrangement of cups in algae infrared radiation for toxicity test

1.2.2 藻温处理方法

T =(Tn1+ Tn2+ Tn3)÷3

(1)

Tni=(Tb1+ Tb2+ Tb3)÷3

(2)

Tbi=(T1+ T2+ T3)÷3

(3)

式中，T为每遍测温测试出的藻温；Tn1、Tn2、Tn3分别为重复1、2、3的平均藻温；Tni为每个重复组的平均藻温，i=1,2,3；Tbi为每个测试杯的平均藻温,i=1,2,3；Tb1、Tb2、Tb3分别为空白、对照、加药的测试杯的平均藻温；Ti为每个测试杯连续测试的藻温(3个藻温)，i=1,2,3。

1.2.3 藻温差计算方法

藻响应温差是指加药组藻温差绝对值与对照组藻温差绝对值的差值，该差值大于零。

ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣，ΔT>0

(4)

加药组藻温差计算：ΔTj=(Tj- ti-Tj- t0)-(Tk-ti-Tk- t0)

(5)

对照组藻温差计算：ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk- ti-Tk- t0)

(6)

式中，Tj- ti为加药后加药组的藻温；Tj- t0为加药前加药组的藻温；Tk-ti为加药后空白组的藻温；Tk- t0为加药前空白组的藻温；Td-ti为加水后对照组的藻温；Td-t0为加水前对照组的藻温；j为加药组，滴加药液；d为对照组，滴加蒸馏水；k为空白组，不滴加药液或蒸馏水；ti为测温遍数，i=0时，为加药前的测温；i=1,2,…,10时，为加药后第1,2,…,10遍测温。

1.3 藻对药液响应的三指标评价法

当藻温差数据同时满足下面3个指标时，表示藻对药液有响应。三指标法如下：

指标①—最大藻温差比较值，即10遍测温中，︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。

指标③—藻响应率(ψ)，即10遍测温中，∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出现次数≥6。

2 结果(Results )

由于2个测试组得到的藻温差不符合藻响应温差定义，不能进行2个测试组的三指标法的比较分析。

2.1 蒸馏水毒性测试实验

2.1.1 不同藻响应率对三指标法影响的分析结果

由表1可知，测试3个藻温的三指标法的藻响应率为60%、50%、70%、80%时，藻无响应结果(真结果)出现率分别是80%、60%、80%、100%，表明设计的藻响应率60%是可行的。

2.1.2 不同指标法分析结果

由表2可知，连测3个藻温的不同指标法评价的真结果重现率：三指标法为80%、①指标法为30%、②指标法为20%、①②指标法为50%，表明三指标法可把假结果出现率控制在20%。

表1 三指标法中藻响应率与测试分析结果Table 1 Algae response rates and test results of the three-index method

注：藻对蒸馏水的响应情况，有响应为“+”，无响应为“-”，下同。

Note: When detecting the response of algae to distilled water, the response is "+", while no response is "-". The same below.

表2 不同指标法的评价结果Table 2 Test results of different index methods

2.1.3 不同测温次数的三指标法分析结果

由表3可知，连测3个藻温的三指标法评价的真结果重现率为80%，测试1个藻温的三指标法评价的真结果重现率为50%，表明每次每杯连测3个藻温的三指标法能够有效控制假结果出现率。

表3 不同测温次数的三指标法评价结果Table 3 Test results of three-index method with different test times for algae temperature

表4 单一、共存重金属毒性的不同指标法评价结果Table 4 Test results of different index methods for single and joint toxicity of heavy metals

注：*共存重金属中各重金属的浓度为第一列中各对应的重金属的浓度。

Note: * The concentration of each heavy metal in coexisting heavy metal solutions is its corresponding concentration in the first column.

2.2 重金属毒性测试实验

2.2.1 不同指标法分析结果

由表4可知，5种重金属单独存在时，藻对其无响应，而它们以4种不同形式共存时，藻对其产生响应。

如表4所示，用平均重现率(%)/重现性(%)评价不同指标法的测试效果，可知在测试共存重金属毒性时，测试3个藻温的所有测试法都为100%/100%，而测试1个藻温的三指标法为83.5%/100%，这表明在共存重金属浓度为0.066～0.156 mg·L-1时，所有评价方法都可评价藻对药液的响应，但测试3个藻温的三指标法优于测试1个藻温的三指标法。

同时如表4所示，测试3个藻温的三指标法的平均重现率(%)/重现性(%)为100%/100%、双指标法为13.4%/80%、单指标法为0%/100%和13.4%/80%，可见双指标法和单指标法评价得到的无响应结果没有重现性，因为它们不能控制假结果出现率；相反，三指标法能够控制假结果出现率。测试1个藻温的三指标法平均重现率(%)/重现性(%)为81.2%/100%，比测试3个藻温的三指标法的重现性低，这也是因为其控制假结果出现率的效果不够理想。由此可知，在单一重金属浓度为0.001～0.1 mgL-1时，测试3个藻温的三指标法评价效果最好。

表5 共存重金属毒性三指标法的评价结果Table 5 Test results of three-index method for joint toxicity of heavy metals

注：藻对药液的响应情况，有响应为“+”，无响应为“-”，下同。

Note: When detecting the response of algae to reagent solution, the response is "+", while no response is "-". The same below.

表6 三指标法评价共存重金属毒性的结果重现性Table 6 Reproducibility of test results of three-index method for joint toxicity of heavy metals

可见测试3个藻温的三指标法能够评价的药液浓度范围更大，可达0.001～0.1 mg·L-1。

2.2.2 共存重金属毒性三指标法评价的分析结果

由表5、表6可知，当4种不同种类重金属共存时，藻均产生了响应，且重现性较好，结果可靠。其中，当5种或4种重金属共存时，结果重现率为100%，高于2种或3种重金属共存时的结果重现率67%，但平均重现率仍达86.8%，表明测试3个藻温的三指标法的灵敏度好。

3 讨论(Discussion)

在10次蒸馏水毒性测试中，若10个测试结果为藻无响应，则表明三指标法的指标阈值设定偏高，可能会导致实测时一些有毒药液毒性不能被测出；若藻有响应的测试结果占多数，则表明指标阈值设定偏低，可能会导致实测时一些无毒药液被测出有毒性；只有藻无响应的测试结果占大多数，才表明藻有响应(假结果)出现率得到控制，指标阈值设定适当，可用于实测药液毒性。测试3个藻温的三指标法能够很好地控制假结果出现率。

分析三指标法的评价效果用的是水平比较法和垂直比较法。水平比较法是指不同指标法测定相同浓度的同一种药液的藻温差的比较方法，用来分析假结果出现的控制效果，如蒸馏水毒性测试实验。垂直比较法是指不同指标法测定不同浓度药液的藻温差的比较方法，用来分析不同指标法的灵敏度，如重金属毒性测试实验。2种比较法的分析结果可知，测试3个藻温的三指标法能够很好地控制假结果出现率(20%)，其藻响应药液浓度范围为0.001～0.1 mg·L-1。

测试结果的可靠性需要重现性分析，当3次实验有2次测试结果相同，测试结果具有重现性。在重金属毒性测试实验中，测试3个藻温的三指标法的测试结果都有重现性，其平均重现率为86.8%、100%，重现性为100%(表4，表6)，表明改进后的技术具有很好的稳定性，测试结果可靠。

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Improving Methods for Algae Infrared Radiation Technology of Testing Chemicals Acute Toxicity

Guo Weihua*, Li Xingguang, Lin Yan, Yang Pengfei

College of Urban Construction and Environment Engineering, Chongqing University, Chongqing 400045, China

In previous acute toxicity tests by algae infrared radiation, the feasibility and stability of results was unsatisfactory, which is due to measuring temperature once each time in each cup, setting only two test groups, and applying single index (maximum of algae temperature difference). In order to solve these problems, an improved method was proposed. The algae temperature was measured three times in each cup during each test, three test groups were set, and three-index method was used instead of single index. The improved technology was applied to toxicity tests of both distilled water and aqueous solution of heavy metals. The results showed that the three-index method can control false results recurrence rate in 20%. When testing the toxicity of four kinds of coexisting heavy metals (0.066-0.156 mg·L-1), the average recurrence rates (%)/reproducibility (%) of all the methods by measuring three algae temperature was 100%/100% whereas that of the method by measuring one algae temperature was 67%/100%. It is indicated that all the methods were effective when the concentration of heavy metals was within 0.066 mg·L-1and 0.156 mg·L-1. During the toxicity test of single heavy metal (0.001-0.1 mg·L-1), the average recurrence rates (%)/reproducibility (%) of the three-index method was 100%/100%, much higher than those of other methods. It is indicated that only the three-index method can be used to evaluate the toxicity of heavy metal within 0.001 mg·L-1and 0.1 mg·L-1. During the toxicity test of five heavy metals (0.001-0.1 mg·L-1), the average recurrence rates (%)/reproducibility (%) of the three-index method was 86.8%/100% on average. Overall, it is demonstrated that the three-index method can obtain better sensibility and stability in testing the acute toxicity of chemicals.

chemicals; algae infrared radiation; three-index method; technical improvement

中央高校基本科研业务费专项项目(106112015CDJXY210004)

郭蔚华(1956-)，男，副教授，研究方向为微生物水处理技术、水环境藻类等，E-mail: gwhchl@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160324052

2016-03-24 录用日期：2016-07-18

1673-5897(2016)6-330-08

X171.5

A

郭蔚华, 李星广, 林艳, 等. 化学品急性毒性藻红外测试技术的方法改进研究[J]. 生态毒理学报，2016, 11(6): 330-337

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