羰基镍急性染毒致大鼠淋巴细胞DNA损伤的剂量时间效应

芦永斌，李宇，马国煜，王秋英，刘静，吴喜江，宣小强，徐东海，程宁,*

1. 兰州大学公共卫生学院，兰州 730000 2. 金川公司镍钴工业卫生研究所，金昌 737103 3. 兰州大学甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州 730000

羰基镍急性染毒致大鼠淋巴细胞DNA损伤的剂量时间效应

芦永斌1，李宇3，马国煜2，王秋英2，刘静3，吴喜江2，宣小强2，徐东海2，程宁3,*

1. 兰州大学公共卫生学院，兰州 730000 2. 金川公司镍钴工业卫生研究所，金昌 737103 3. 兰州大学甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州 730000

通过急性动物实验观察不同剂量羰基镍(Ni(CO)4)染毒对大鼠淋巴细胞DNA的损伤程度。采用静态方式对SD大鼠染毒30 min，以羰基镍20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3为低、中和高剂量染毒组，250 mg·m-3氯气染毒组为阳性对照组，未染毒组为正常对照组。大鼠染毒后1 d、2 d、3 d和7 d分别收集样本。采用单细胞凝胶电泳测量淋巴细胞DNA的损伤程度。通过对所得彗星图像的尾长和Olive尾距(OTM)指标结果分析发现，大鼠淋巴细胞损伤程度随着羰基镍染毒剂量的增加而增加，4个时间点各剂量组间均有显著差异(P<0.05)，4个剂量组各时间点均有显著差异(P<0.05)，且随时间变化有一定的变化规律，损伤程度在3 d时达最大，而后缓慢下降；在高剂量组染毒和染毒后3 d，损伤程度达到最大。急性羰基镍染毒可致淋巴细胞DNA显著损伤，且存在明显的剂量、时间和交互效应。

羰基镍；大鼠；淋巴细胞；DNA损伤；剂量效应关系；时间效应关系；交互效应关系

羰基镍是镍和一氧化碳在一定压力下反应而生成的一种金属化合物，它以蒸气形态迅速由呼吸道吸入，造成急性中毒反应[2]。动物实验表明急性吸入羰基镍肺脏损伤最为严重[3]，其次为肝脏等脏器[4]。羰基镍急性中毒对外周血淋巴细胞的损伤效应国内外报道很少[5]。有研究表明Ni2+主要作用于遗传物质，引起DNA氧化损伤[6]。魏巧妙等[7]的研究也显示镍及其化合物导致DNA损伤，Ni2+通过与细胞质、细胞核中不同配体形成多种复合物，影响细胞功能，这些复合物通过铁离子催化Fenton反应，抑制DNA损伤修复酶的活性，从而引起DNA的氧化损伤。本实验利用单细胞凝胶电泳(SCGE)观测不同剂量羰基镍染毒后不同时间点大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤情况，分析其剂量及时间变化规律。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验方法

SPF级SD大鼠170只，雌雄各半，体重180～200 g(西安交通大学提供，许可证号SCXK (陕)2007 -001)。按照性别随机分成4个组，由一个正常对照组(10只)和4个染毒组(40只/组)。根据大鼠静态吸入羰基镍30 min半数致死浓度的5%、33.8%和62.5%进行低、中、高剂量羰基镍染毒，浓度分别为20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3；氯气染毒组(250 mg·m-3)为阳性对照组；正常对照组不做处理。静态方式染毒30 min。分别于染毒后1 d、2 d、3 d、和7 d共4个时间点处死取材。

1.2 单细胞凝胶电泳技术(SCGE)

按单细胞凝胶电泳实验进行操作和分析[8]，对于实验条件进行了改良，改良部分包括胶体调整为底胶层、细胞层低熔点胶层、低熔点胶层，具体仪器及操作过程详见文献[9]。

1.3 统计学处理

表1 各染毒组不同染毒时间大鼠淋巴细胞DNA的尾长(μm)Table 1 Tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，与正常对照组比较，P<0.05；b，与氯气染毒组比较，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

2 结果(Results)

2.1 羰基镍对淋巴细胞的损伤情况

从表1可以看出，在4个时间点，不同羰基镍染毒组尾长随着剂量的增加而增加；各染毒组在3 d时尾长达最大，7 d又有所下降，提示存在剂量效应关系。经LSD法多重比较可以看出不同羰基镍染毒组与正常对照组的尾长之间均有差异(P<0.05)。阳性对照组染毒后，尾长先增加后降低，2 d时达到最大。

从表2中可以看出，在4个时间点，不同羰基镍染毒组Olive尾矩(OTM)随着剂量的增加而增加；各染毒组OTM在3 d达到最大，7 d又有所下降，提示存在剂量效应关系。经LSD法多重比较可以看出不同羰基镍染毒组与正常对照组的OTM均数之间均有差异(P<0.05)。氯气对照组染毒后，OTM先增加后降低，2 d达到最大。

2.2 羰基镍染毒剂量与尾长和OTM的剂量效应关系

从表3可以看出，在同一时间点，羰基镍染毒剂量与尾长之间呈线性相关，随着染毒剂量增加尾长也逐渐增加，提示DNA损伤程度逐渐增强，存在明显的剂量效应关系；染毒剂量与OTM之间呈曲线相关，在一定染毒剂量下，随着染毒剂量增加OTM

表2 各染毒组不同染毒时间大鼠淋巴细胞DNA的Olive尾矩Table 2 Olive tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，与正常对照组比较，P<0.05；b，与氯气染毒组比较，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

表3 羰基镍染毒剂量与尾长和Olive尾矩的剂量效应关系Table 3 Dose-response relationships between nickel carbonyl dose and tail moment and Olive tail moment

表4 羰基镍染毒时间与尾长和Olive尾矩的时间效应关系Table 4 Time-response relationships between nickel carbonyl infected time and tail moment and Olive tail moment

逐渐增加，提示DNA损伤程度逐渐增强，存在明显的剂量效应关系。在7 d时OTM不再随着剂量的增加而增加，而是出现缓慢下降状态。

2.3 羰基镍染毒后时间与尾长和OTM的时间效应关系

从表4可以看出，在同一染毒组中，羰基镍染毒后时间与尾长呈曲线相关，存在时间效应关系，分别在0～0.75、0～2.31、0～2.32 d内，尾长逐渐增加，提示淋巴细胞DNA损伤程度逐渐增强；染毒时间与OTM呈曲线相关，存在时间效应关系，分别在0～2.46、0～1.88、0～2.41、0～2.31 d内，OTM逐渐增加，提示DNA损伤程度逐渐增强。

2.4 染毒剂量与时间的交互作用

在尾长和OTM指标测定中，染毒后时间和染毒剂量之间存在明显的交互作用，差异有统计学意义(F=30.507、P=0.000，F=38.427、P=0.000)。在3 d和高剂量组中，尾长和OTM均达到最大，提示损伤程度达到最大；在7 d和高剂量组中，尾长和OTM均达到最小，提示损伤程度降到最小，见图1。

图1 染毒剂量和时间的交互作用Fig. 1 Interaction effect relationships between dose and time infected

3 讨论(Discussion)

羰基镍是急性毒性最强的一类镍化合物[10]。短时间大量吸入可发生急性中毒，累及机体多种重要器官。王宁等[11]研究发现，急性羰基镍中毒对大鼠肺、肝、肾靶器官细胞的DNA均有一定的损伤作用。刘静等[6]的研究提示镍化合物导致明显的DNA单链断裂发生，表明DNA或蛋白质受到损伤。M’Bemba-Meka等[12]实验证明，镍化合物导致人体血液淋巴细胞的染色体和核染色质DNA链断裂。SCGE是一种快速检测单细胞DNA完整性的实验技术。SCGE中彗尾的出现是细胞DNA断裂的一个标志，能反映DNA损伤程度和损伤特征[13]。细胞DNA受损愈重，产生的断链或断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为彗星尾长增加和彗星尾部荧光强度增强。本实验对羰基镍急性中毒大鼠淋巴细胞DNA损伤的彗星图像进行分析，统计了彗星尾长和OTM这2个指标，探讨羰基镍急性中毒对大鼠淋巴细胞DNA损伤，以及剂量和时间对其损伤的影响。

本实验结果显示大鼠吸入不同剂量的羰基镍后，对淋巴细胞DNA有损伤作用，呈明显的剂量和时间效应关系。以高剂量组的损伤作用最为明显。在染毒后1 d、2 d和3 d，低、中、高、氯气对照组损伤程度均高于正常对照组，呈明显的剂量效应关系，随着剂量增加，淋巴细胞DNA损伤加重，且在高剂量组(250 mg·m-3)时损伤程度达到最大。Werfel等[14]研究显示，接触镍烟尘的电焊工人淋巴细胞DNA链断裂情况与Ni2+的浓度呈正相关，与本研究结论一致。这可能是大剂量的羰基镍进入体内后，对机体产生严重损伤。本实验结果还提示染毒后时间对DNA损伤作用的影响明显，低、中和高剂量组在染毒后3 d损伤程度最大；从变化趋势上看，染毒后3 d损伤达最高，7 d又有所下降，但尚未恢复至正常水平，原因可能是一定时间后排泄系统加大毒物排泄，毒物在体内的分布减少所致。有研究报道显示羰基镍无明显蓄积性，吸入后6 h内即有30%～40%由呼气中排出，吸入后1 d，体内仅存留吸入量的17%，镍还可以随粪和尿排出[15]。急性羰基镍中毒后临床病程中，死亡病例一般发生于中毒后3 d之内，存活者中毒症状也以3 d内最重，7 d后症状消失，提示存在时间效应关系，这与本实验结论一致。氯气对照组染毒后，损伤程度先加重后降低，2 d达到最大值，且损伤程度也低于羰基镍染毒高剂量组，提示羰基镍的毒性及持续时间强于氯气。通过上述2个指标观察到羰基镍可以引起淋巴细胞DNA损伤，且随着剂量增加损伤程度也随之增加。

致谢：感谢耶鲁大学的Cynthia Chan在文章修改中给予的帮助。

[1] Sunderman F W. A pilgrimage into the archives of nickel toxicology [J]. Annals of Clinical & Laboratory Science, 1989, 19: 1-16

[2] 时海英, 王宁, 王秋英, 等. 急性羰基镍中毒大鼠肺脏Na+-K+ATP酶活性及其基因表达的观察[J]. 卫生研究, 2013, 42: 818-821

Shi H Y, Wang N, Wang Q Y, et al. Observation on both Na+-K+ATPase activity and expression of Na+-K+ATPase α1mRNA in lung tissues of rats acute poisoned with nickel carbonyl [J]. Journal of Hygiene Research, 2013, 42: 818-821 (in Chinese)

[3] 周巧玲, 闫铭峰, 王秋英, 等. 大鼠急性羰基镍中毒抗超氧阴离子变化的实验观察[J]. 工业卫生与职业病, 2013, 39(6): 332-335

Zhou Q L, Yan M F, Wang Q Y, et al. Changes of anti-superoxide anion during acute nickel carbonyl poisoning of rats in an experimental observational study [J]. Industrial Health and Occupaiona Disease, 2013, 39(6): 332-335 (in Chinese)

[4] Seet R C, Johan A, Teo C E, et al. Inhalational nickel carbonyl poisoning in waste processing workers [J]. Chest, 2005, 128: 424-429

[5] 王辉, 程宁. 镍化合物致氧化应激损伤机制的研究进展[J]. 工业卫生与职业病, 2014, 40(5): 390-392

[6] 刘静, 程宁. 镍化合物细胞毒理学研究的某些进展[J]. 工业卫生与职业病, 2010, 36(5): 306-309

[7] 魏巧妙, 程宁. 镍及其化合物DNA损伤的研究进展[J]. 工业卫生与职业病, 2015, 41(6): 471-473

[8] 张遵真, 衡正昌. 用单细胞凝胶电泳技术检测铬和砷化物的DNA损伤作用[J]. 中华预防医学杂志, 1997, 31(6): 365-367

[9] 李宇. 大鼠急性羰基镍中毒的细胞与分子机制的实验研究[D]. 兰州: 兰州大学, 2009: 9-14

Li Y. Research on the cell and molecule mechanisum of acute toxicity of nickel carbonyl in rats [D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2009: 9-14 (in Chinese)

[10] Proietti L, Ferrara A, Freni V, et al. Adverse reaction following suspected inhalation of nickel tetracarbonyl: Case report [J]. LaMedicina del Lavoro, 2005, 96: 155-161

[11] 王宁, 程宁, 王秋英. 急性羰基镍中毒大鼠不同脏器Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶活性的动态观察[J]. 卫生研究, 2015, 44(2): 341-346

[12] M’Bemba-Meka P, Lemieux N, Chakrabarti S K. Nickel compound-induced DNA single-strand breaks in chromosomal and nuclear chromatin in human blood lymphocytes in vitro: Role of oxidative stress and intracellular calcium [J]. Mutation Research/genetic Toxicology & Environmental Mutagenesis, 2005, 586: 124-137

[13] Kassie F, Parzefall W, Knasmüller S. Single cell gel electrophoresis assay: A new technique for human biomonitoring studies [J]. Mutation Research/Fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2000, 463: 13-31

[14] Werfel U, Langen V, Eickhoff I, et al. Elevated DNA single-strand breakage frequencies in lymphocytes of welders exposed to chromium and nickel [J]. Carcinogenesis, 1998, 19: 413-418

[15] 严永华, 杜鹃, 吴晓琴, 等. 羰基镍中毒[J]. 工业卫生与应急救援, 2002, 20: 221-223

Yan Y H, Du J, Wu X Q, et al. Nickel carbonyl poisoning [J]. Industrial Health & Emergency Rescue, 2002, 20: 221-223 (in Chinese)

◆

Dose-Response and Time-Effect Relationships between Lymphocyte DNA Damage of Rats Poisoned with Nickel Carbonyl

Lu Yongbin1, Li Yu3, Ma Guoyu2, Wang Qiuying2, Liu Jing3, Wu Xijiang2, Xuan Xiaoqiang2, Xu Donghai2, Cheng Ning3,*

1. School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Jinchuan Nickel and Cobalt Industrial Health Institute, Jinchang 737103, China 3. Provincial Key Laboratory of Pre-clinical Study of New Pharmaceuticals, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Received 3 May 2016 accepted 26 June 2016

To investigate DNA damage in SD rat peripheral blood lymphocytes under different doses of nickel carbonyl, SD rats were exposed through inhalation of 20, 135, 250 mg·m-3nickel carbonyl (Ni(CO)4) for 30 minutes. Rats poisoned by 250 mg·m-3chlorine gas served as the positive control group, and healthy SD rats served as the control group. After 1 day (d), 2 d, 3 d, and 7 d inhalation, bone marrow samples were taken from the rats. Single cell gel eletrophoresis (SCGE) was used to measure comet tail moment, and Olive tail moment was measured from the comet image, to determine lymphocytes DNA damage. Lymphocytes DNA damage increased with increasing Ni(CO)4dose. The significant differences were observed in different doses and times (P<0.05). Extreme DNA damage was found after 3 d and decreased after 7 d in Ni(CO)4groups. The damage increased with inhalation time. Extreme DNA damage was found at the highest dose and 3 d exposure. Acute nickel carbonyl could induce lymphocyte DNA damage in dose-response, time-effect and interaction effect manner.

nickel carbonyl; rat; lymphocyte; DNA damage; dose-response relationship; time- effect relationship; interaction effect relationship

金川集团公司与兰州大学产学研合作项目

芦永斌(1989-)，男，硕士，研究方向为流行病与卫生统计学，E-mail: luyb14@lzu.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160503003

2016-05-03 录用日期：2016-06-26

1673-5897(2016)6-277-05

X171.5

A

程宁(1959—)，男，教授，研究方向为安全性评价。

芦永斌, 李宇, 马国煜, 等. 羰基镍急性染毒致大鼠淋巴细胞DNA损伤的剂量时间效应[J]. 生态毒理学报，2016, 11(6): 277-281

Lu Y B, Li Y, Ma G Y, et al. Dose-response and time-effect relationships between lymphocyte DNA damage of rats poisoned with nickel carbonyl [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 277-281 (in Chinese)