4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同剂型对斑马鱼急性毒性效应

贾伟，蒋红云，张兰，张燕宁，毛连刚

中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193

4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同剂型对斑马鱼急性毒性效应

贾伟，蒋红云*，张兰，张燕宁，毛连刚

中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193

采用半静态法测定了4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂原药及制剂对斑马鱼(Brachydonio rerio)急性毒性。结果表明，以实测浓度计，250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂对斑马鱼的96 h半数致死浓度(LC50)值为0.539 mg·L-1，急性毒性为高毒，95%嘧菌酯原药和50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼的LC50(96 h)值分别为1.09和1.21 mg·L-1，急性毒性均为中毒；98%啶氧菌酯原药和22.5%的啶氧菌酯悬浮剂对斑马鱼的LC50(96 h)值分别为0.0974和0.0972 mg·L-1，急性毒性均为剧毒；95%吡唑醚菌酯原药、15%吡唑醚菌酯悬浮剂和250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油对斑马鱼的LC50(96 h)值为0.0613、0.0549和0.0487 mg·L-1，急性毒性均为剧毒；95%醚菌酯原药和50%醚菌酯水分散粒剂对斑马鱼的LC50(96 h)值分别为0.468和0.702 mg·L-1，急性毒性均为高毒。这4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼均有较高风险，会对其他水生生物也存在潜在的风险。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂；斑马鱼；急性毒性；剂型；中毒症状

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是基于天然抗生素粘液蜜环菌(strobilurin A)为先导化合物开发的新型杀菌剂，几乎对所有真菌类病害均具有良好的生物活性。其作用机理是通过抑制病原菌细胞线粒体中色素b和c1之间的电子传递，从而抑制线粒体呼吸作用，最终导致病原菌细胞死亡[1]。自1996年巴斯夫开发了第1个甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂醚菌酯(kresoxim-methyl)以来，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂凭借其独特的作用方式经过多年的发展，在世界杀菌剂市场中占据了主导地位，被广泛应用于真菌纲病害防治。目前广泛应用的品种有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯等[2]。

农药在施用过程中由于喷洒和流失会进入附近的土壤和水体环境中，从而进一步污染土壤和水体，并引起土壤和水体中非靶标生物的中毒或死亡[3-4]。目前，随着甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂广泛应用，尤其是在水稻田中的大面积应用，使得水生生态系统面临这类杀菌剂的污染程度也越来越严重[5]。研究表明，嘧菌酯会对水生藻类、大型无脊椎动物及脊椎动物等水生生物产生影响[6]。嘧菌酯在径流水中浓度范围为1～30 μg·L-1[7-9]，此浓度范围的嘧菌酯会对桡足类哲水蚤产生毒性[10]，同时会影响线粒体的呼吸作用机制，对大西洋鲑鱼仔鱼产生不利影响[11]。嘧菌酯也可以抑制绿狐尾藻的抗氧化酶系统，产生脂质过氧化损伤和DNA损伤[12]，还会导致无脊椎动物和脊椎动物染色体断裂，产生遗传毒性[13-14]。同时，李鹏鹏[15]通过研究表明，50%的醚菌酯水分散粒剂和50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼均表现为中等毒性。此外，肟菌酯和烯肟菌酯同样会对水生生物产生影响。Shen等[16]的研究表明，肟菌酯会影响抗氧化酶的活性，使小球藻的光合作用紊乱，并破坏细胞结构。Junges等[17]通过实验研究鱼和蝌蚪的相互作用发现，亚致死浓度的肟菌酯可以改变被捕食者行为，间接改变被捕食者与捕食者之间的相互作用。捕食者与被捕食者之间的关系作为对毒物暴露的可衡量反应提供了污染物如何改变捕食者与被捕食者之前相互作用的生物视角。杨红莲等[18]也通过研究表明，烯肟菌胺对斑马鱼有明显的毒性作用，造成斑马鱼胚胎发育迟缓，胚胎孵化率和存活率明显降低，同时还出现了卵黄膜外凸、仔鱼心包水肿和尾巴弯曲等畸形。生态毒性效应研究结果表明该类杀菌剂对水生生物有高生态风险。因此，综合评价甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类的安全性对于规避农药使用的环境风险具有重要意义。

本文采用半静态法研究了95%嘧菌酯原药、50%嘧菌酯水分散粒剂、250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂、95%醚菌酯原药、50%醚菌酯水分散粒剂、95%吡唑醚菌酯原药、15%吡唑醚菌酯悬浮剂、250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油、98%啶氧菌酯原药、22.5%啶氧菌酯悬浮剂等10种试剂对斑马鱼的急性毒性，通过研究不同剂型与原药对斑马鱼的毒性，为评价此类杀菌剂对水生生物的影响提供基础研究数据，为指导在实际生产中绿色环保剂型的研发及不同剂型在不同环境中的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 受试生物及实验用水

实验所用斑马鱼(Brachydanio rerio)购于北京仁和水族养殖中心，鱼龄3～5个月，体长(2.51±0.5) cm，体重(0.305±0.1) g。试验前在实验室条件下驯养7 d以上，死亡率保持在5‰以下，挑选健康无病个体进行实验。每天光照12 h，驯养期间每天喂食1～2次市售成品鱼饵料，并及时清除食物残渣及粪便。实验前24 h停止喂食，实验期间不喂食。

实验用水为经24 h除氯后的自来水，pH值为7.5～8.5，水质硬度在250～300 mg·L-1之间(以CaCO3计)，溶氧量保持在5.8 mg·L-1以上，实验温度在(23±1) ℃。

1.1.2 供试药品

供试药品如表1所示。

1.1.3 实验仪器

SG68多参数测试仪(梅特勒-托利多仪器有限公司)、YD300便携式水质硬度仪(上海三信仪表厂)、AnKeTDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)、N-EVAP型氮吹仪(美国Organomation公司)、Agilent7890A(ECD)气相色谱仪(美国安捷伦公司)、超高效液相色谱质谱联用仪(ACQUITY TQD)(美国Waters公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 参比实验

以斑马鱼为生物试材，进行分析纯的重铬酸钾参比实验，参比物质重铬酸钾对斑马鱼24 h的LC50应处于200～400 a.i.mg·L-1之间。

1.2.2 斑马鱼急性毒性实验

采用OECD(TG 203)实验方法中的半静态法，在农业部认证的国内GLP实验室(中国农业科学院植物保护研究所农药环境评价实验室)进行实验。首先进行预实验，根据实验方法，设置若干组间距较大的浓度，每组处理10尾驯养好的斑马鱼，不设重复，观察并记录96 h斑马鱼的中毒症状及试验结果。

根据预实验结果，正式实验设置6个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个平行(表2)，同时设置空白对照组(实验用水均为曝气24 h自来水)及溶剂对照组(丙酮，用量小于0.05 mL·L-1)，取10尾驯养好的斑马鱼于装有5 L曝气水的玻璃缸中。实验期间不喂食，及时清除死亡斑马鱼，分别于24、48、72、96 h观察并记录斑马鱼死亡数及中毒症状。

1.2.3 供试药剂含量测定

1.2.3.1 样品提取与净化

嘧菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯试液样品的提取与净化：分别吸取5 mL不同处理组中的试液于10 mL离心管中，加入5 mL乙腈，震荡30 s，后加入2 g NaCl和3 g MgSO4，震荡1 min，后4 000 rmin-1离心5 min，取1 mL上层液体过0.22 μm有机滤膜于棕色进样瓶中，待测。

醚菌酯试液样品的提取与净化：分别吸取5 mL不同处理组中的试液于10 mL离心管中，加入5 mL乙腈，震荡30 s，后加入2 g NaCl和3 g MgSO4，再震荡1 min，后4 000 rmin-1离心5 min，吸取2 mL上层溶液于10 mL塑料离心管中，后用氮吹仪吹干，冷却后加入2 mL丙酮，吸取1 mL过0.22 μm有机滤膜于棕色进样瓶中，待测。

表1 供试药品信息Table 1 The information of test pesticides

1.2.3.2 分析条件

嘧菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯的分析条件：3种样品采用超高效液相色谱与质谱联用(UPLC-MSMS)法检测，ACQUITYUPLC®BEHC181.7 μm色谱柱，采用梯度洗脱，柱温30 ℃，进样体积3 μL。质谱采用ESI(电喷雾离子源)正源多重反应检测(MRM)模式，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气流量600 L·h-1，锥孔气流量50 L·h-1；此条件下，嘧菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯的保留时间分别约为2.1 min、2.24 min和2.32 min。

醚菌酯分析条件：采用气相色谱(GC)法分析，毛细管色谱柱为HP-5(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；升温程序为80 ℃保持1 min，然后以20 ℃·min-1升温至200 ℃，保持3 min，最后以10 ℃·min-1升温至250 ℃，保持5 min；检测器为微池电子捕获检测器(μECD)，氢气75 mL·min-1，空气100 mL·min-1，检测器温度300 ℃；进样口温度为250 ℃；进样量为1.00 μL；载气为氮气，纯度≥99.99%，流速为30 mL·min-1；醚菌酯的保留时间约为14.86 min。

1.2.3.3 标准曲线和添加回收

以乙腈为溶剂，采用梯度稀释，配成各供试药剂的标准工作液，嘧菌酯溶液浓度为2.4、0.6、0.15、0.05、0.005 mg·L-1，啶氧菌酯溶液浓度为2.4、0.48、0.06、0.02、0.002 mg·L-1，醚菌酯溶液浓度为2.15、0.86、0.43、0.1、0.05 mg·L-1，吡唑醚菌酯溶液浓度为0.6、0.2、0.05、0.01、0.001 mg·L-1，采用以上各试剂的分析条件检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程分别为嘧菌酯y=58526x+1656.3(R2=0.9995)，啶氧菌酯y=13.9x+538.0(R2=0.9980)，醚菌酯y=5529.7x-127(R2=0.9998)，吡唑醚菌酯y=86580x+1580.9(R2=0.9901)。

将不同浓度的各试剂的标准溶液分别添加至曝气自来水中，进行添加回收率实验。结果表明(表3)，嘧菌酯的添加回收率为105%～111%，相对标准偏差(RSD)为0.925%～6.39%；啶氧菌酯的添加回收率为85%～112%，RSD为0.570%～6.58%；醚菌酯的添加回收率为88.5%～108%，RSD为0.486%～2.09%；吡唑醚菌酯的添加回收率为90.6%～104%，RSD为1.11%～6.52%。

1.3 实验结果处理

实验结果数据用DPS统计软件处理，计算4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼24、48、72及96 h的LC50和95%置信限。依据《化学农药环境安全评价试验准则》[19](GB/T 31270.12—2014)规定的化学农药对鱼类急性毒性的评价标准：LC50> 10 mg·L-1，低毒；1.0 mg·L-1≤ LC50≤10 mg·L-1，中毒；0.1 mg·L-1≤LC50≤1.0 mg·L-1，高毒；LC50≤0.1 mg·L-1，剧毒。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 参比实验

为验证实验方法的有效性，以斑马鱼为生物试材进行分析纯的重铬酸钾实验，测得LC50(24 h)为265.7 mg·L-1。因此，斑马鱼参比实验结果在标准要求范围内，本实验结果可靠。

2.2 实测浓度与标示浓度的对比

由表2可知，除95%醚菌酯原药最低浓度的实测值高于理论值外，其余均低于理论值，这是由于农药在加入水中时，一部分农药会扩散入大气中[20]，进入水体的部分农药会因为阳光的照射而发生光解，也会受水体的pH、温度和离子强度等因素的影响发生不同程度的水解[21]，此外水体中的农药会通过沉淀、吸附和解吸附及生物体内水解酶的作用而发生生物降解，因此水中农药的实际含量低于理论值[22]。

2.3 4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的不同剂型对斑马鱼的急性毒性

2.3.1 嘧菌酯原药及其制剂对斑马鱼的急性毒性

由表4可知，95%嘧菌酯原药、50%嘧菌酯水分散粒剂、250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂对斑马鱼的LC50(96 h)值和95%置信限分别为1.09(1.03～1.16)、1.21(1.07～1.39)和0.539(0.519～0.572) mg·L-1，50%嘧菌酯水分散粒剂的LC50(96 h)值是95%嘧菌酯原药LC50(96 h)值的1.11倍，95%嘧菌酯原药和50%嘧菌酯水分散粒剂的LC50(96 h)值分别是250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂LC50(96 h)值的2.02倍和2.24倍。根据LC50(96 h)值的大小划分等级，250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂对斑马鱼的毒性为高毒，95%嘧菌酯原药、50%嘧菌酯水分散粒剂对斑马鱼的毒性为中毒。3种试剂对斑马鱼96 h毒性大小依次为：250 g·L-1的嘧菌酯悬浮剂>95%嘧菌酯原药>50%嘧菌酯水分散粒剂。

2.3.2 啶氧菌酯原药及其制剂对斑马鱼的急性毒性

由表5可知，98%啶氧菌酯原药和22.5%啶氧菌酯悬浮剂对斑马鱼的LC50(96 h)值和95%置信限分别为0.0974(0.0913～0.108)和0.0972(0.0929～0.106) mg·L-1，22.5%啶氧菌酯悬浮剂的LC50(96 h)略低于98%啶氧菌酯原药。根据LC50(96 h)值的大小划分等级，98%啶氧菌酯原药和22.5%啶氧菌酯悬浮剂对斑马鱼的毒性均为剧毒。

2.3.3 醚菌酯原药及其制剂对斑马鱼的急性毒性

由表6可知，95%醚菌酯原药和50%醚菌酯水分散粒剂对斑马鱼的LC50(96 h)值和95%置信限分别为0.468(0.445～0.523)和0.702(0.658～0.754) mg·L-1，50%醚菌酯水分散粒剂的LC50(96 h)值是95%醚菌酯原药LC50(96 h)值的1.50倍，但根据LC50(96 h)值的大小划分等级，95%醚菌酯原药和50%醚菌酯水分散粒剂对斑马鱼的毒性均为高毒。2种试剂对斑马鱼的96 h毒性大小依次为：95%醚菌酯原药>50%醚菌酯水分散粒剂。

2.3.4 吡唑醚菌酯原药及其制剂对斑马鱼的急性毒性

由表7可知，95%吡唑醚菌酯原药、15%吡唑醚菌酯悬浮剂和15%吡唑醚菌酯乳油对斑马鱼的LC50(96 h)值和95%置信限分别为0.0613(0.0565～0.0657)、0.0549(0.0508～0.0582)和0.0487(0.0446～0.0511) mg·L-1，95%吡唑醚菌酯原药的LC50(96 h)值分别是15%吡唑醚菌酯悬浮剂和15%吡唑醚菌酯乳油LC50(96 h)值的1.12倍和1.26倍，而15%吡唑醚菌酯悬浮剂的LC50(96 h)值是15%吡唑醚菌酯乳油LC50(96 h)值的1.13倍。根据LC50(96 h)值的大小划分等级，95%吡唑醚菌酯原药、15%吡唑醚菌酯悬浮剂和15%吡唑醚菌酯乳油对斑马鱼的毒性均为剧毒。3种试剂对斑马鱼的96 h毒性大小依次为：15%吡唑醚菌酯乳油>15%吡唑醚菌酯悬浮剂>95%吡唑醚菌酯原药。

表2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼急性毒性实验的暴露浓度Table 2 Experimental concentration of the studied strobilurin fungicides in acute toxicity test on zebrafish

表3 嘧菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯在曝气自来水中的平均添加回收率(mean±SD, n=5)Table 3 Average recoveries of azoxystrobin,picoxystrobin, pyraclostrobin and kresoxim-methyl in aerated tap-water (mean±SD, n=5)

2.3 斑马鱼的中毒症状

2.3.1 4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼染毒后的相同症状

染毒开始后，斑马鱼先静止在水底，之后开始出现剧烈不规律游动，有顶水现象，呼吸速率随染毒时间的延长而先加快后减慢，呼吸幅度由小变大，体色随染毒时间加长而逐渐加深，身体逐渐失去平衡，上下翻转挣扎游动，死亡时鱼肚上翻，鱼肚发白。实验过程中，染毒剂量越高，斑马鱼中毒症状出现越早，表现越明显，随剂量的增高，染毒时间的延长，斑马鱼的死亡率越高，存在明显的剂量效应。

2.3.2 4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼染毒后的不同症状

嘧菌酯染毒后，斑马鱼鱼鳃有淤血，而醚菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯处理后的斑马鱼则是胸鳍根部有淤血。斑马鱼死亡后，嘧菌酯和醚菌酯处理的斑马鱼鱼体沉入水底，而啶氧菌酯和吡唑醚菌酯处理的斑马鱼则浮于水面。

表4 嘧菌酯对斑马鱼的急性毒性Table 4 Acute toxicity of azoxystrobin to zebrafish

表5 啶氧菌酯对斑马鱼的急性毒性Table 5 Acute toxicity of picoxystrobin to zebrafish

表6 醚菌酯对斑马鱼的急性毒性Table 6 Acute toxicity of kresoxim-methyl to zebrafish

表7 吡唑醚菌酯对斑马鱼的急性毒性Table 7 Acute toxicity of pyraclostrobin to zebrafish

3 讨论(Discussion)

研究结果表明，嘧菌酯原药及其2种制剂对斑马鱼具有很高的毒性风险，其中嘧菌酯悬浮剂比嘧菌酯原药的毒性高，而嘧菌酯水分散粒剂则低于原药的毒性，说明嘧菌酯的毒性会受制剂剂型的影响。对本研究与张国福等[23]的研究结果综合分析表明，嘧菌酯随水质硬度的降低，有LC50值逐渐减小，毒性增强的趋势，虽然结果略有差异，但其毒性非常接近高毒，说明嘧菌酯对斑马鱼存在较高毒性风险。啶氧菌酯原药LC50值与刘小波等[24]的研究结果略有差异，但都表明啶氧菌酯原药对斑马鱼具有很高的毒性风险。啶氧菌酯悬浮剂的毒性为剧毒，对斑马鱼同样存在很高的毒性风险，目前还未见到对其毒性的相关报道。吡唑醚菌酯原药及其制剂的LC50值很接近，对斑马鱼毒性均为剧毒，说明吡唑醚菌酯对斑马鱼存在很高的毒性风险[25]。醚菌酯及其制剂的毒性均为高毒，其中50%醚菌酯水分散粒剂的LC50值虽然与李鹏鹏[15]实验结果略有差异，但是毒性等级划分一致，说明醚菌酯对斑马鱼存在很高的毒性风险。

此外，由于不同剂型中的成分复杂，即使是同种剂型，不同厂家的产品的毒性也无法保持一致，因此各种剂型的毒性评价非常困难。综合分析本研究中的实验结果，水分散粒剂的LC50值都高于原药，而悬浮剂的LC50值则低于原药，虽然悬浮剂和水分散粒剂均能使药剂均匀分散并悬浮于水中，但水分散粒剂在水中的悬浮率低于悬浮剂[26]，更容易沉入水底，因而其毒性比悬浮剂低。本研究中的乳油剂型毒性均高于其他剂型，可能是因为其乳油生产中需要大量的溶剂，溶剂的主要品种有苯、甲苯、二甲苯、甲醇、二甲基甲酰胺等，会导致生物慢性中毒，造成严重的环境污染，而且损害人体健康[27-28]。此外本研究中的结果显示，原药毒性越高，其不同制剂的毒性受剂型的影响越小，反之亦成立。3种剂型的毒性由高到低依次为乳油、悬浮剂、水分散粒剂，且均对水生生物的毒性很高，因此亟需开发高效低毒、绿色环保的新剂型[29]。

综合以上研究，这4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对斑马鱼均有较高风险，因此可能会对其他水生生物存在潜在的风险，农药进入水体生态环境后，直接影响水生生物的生活环境[30]，因此在实际生产中合理规范地使用此类药剂，在达到预期效果的同时注意保护环境。此外，此类杀菌剂对斑马鱼的致毒机理尚不明确，还需进一步研究。

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Acute Toxicity of Different Formulation of Four Strobilurin Fungicides to the Zebrafish (Brachydoniorerio)

Jia Wei, Jiang Hongyun*, Zhang Lan, Zhang Yanning, Mao Liangang

Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

Received 5 March 2016 accepted 15 May 2016

Acute toxicity of different formulation of four strobilurin fungicides to zebrafish (Brachydonio rerio) was detected with the semi-static method. Based on measured concentrations, results showed that 250 g·L-1azoxystrobin suspension concentrate (SC) is very toxic to zebrafish with an LC50(96 h) value of 0.539 mg·L-1. In contrast, 95% azoxystrobin technical material (TC) and 50% azoxystrobin water dispersible granule (WG) were moderately toxic to zebrafish with LC50(96 h) values of 1.09 and 1.21 mg·L-1, respectively. Both 98% picoxystrobin TC and 22.5% picoxystrobin SC were extremely toxic to zebrafish with LC50(96 h) values of 0.0974 and 0.0972 mg·L-1. All test fungicides pyraclostrobin were also extremely toxic to zebrafish with the relative toxicity (LC50) in decreasing order as follows: 95% pyraclostrobin TC (0.0613 mg·L-1)> 15% pyraclostrobin SC (0.0549 mg·L-1)>250 g·L-1pyraclostrobin emulsifiable concentrates (EC) (0.0487 mg·L-1). 95% kresoxim-methyl TC and 50% kresoxim-methyl WG were very toxic to zebrafish, and their LC50(96 h) values were 0.468 and 0.702 mg·L-1, respectively. These results suggested that all tested strobilurin fungicides have the potential risk to zebrafish and the other aquatic organisms.

strobilurin fungicides; zebrafish; acute toxicity; pesticide formation; toxic symptom

国家自然科学基金(31272079，31171967)

贾伟(1990-)，男，山东泰安人，硕士研究生，研究方向为环境毒理研究，E-mail: weijia0991@126.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: ptnpc@vip.163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160305001

2016-03-05 录用日期：2016-05-15

1673-5897(2016)6-242-10

X171.5

A

蒋红云(1967—)，女，农学博士，研究员，主要研究方向农药毒理学，发表学术论文50余篇。

贾伟, 蒋红云, 张兰, 等. 4种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同剂型对斑马鱼急性毒性效应[J]. 生态毒理学报，2016, 11(6): 242-251

Jia W, Jiang H Y, Zhang L, et al. Acute Toxicity of different formulation of four strobilurin fungicides to the zebrafish (Brachydonio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 242-251 (in Chinese)