UPLC法快速测定葡萄酒中的防腐剂脱氢乙酸

俞子萱，杨爽，葛宝坤，宋旭（天津出入境检验检疫局，天津300461）



UPLC法快速测定葡萄酒中的防腐剂脱氢乙酸

俞子萱，杨爽，葛宝坤*，宋旭
（天津出入境检验检疫局，天津300461）

摘要：建立超高效液相色谱法（UPLC）、二极管阵列检测器（PAD）快速测定葡萄酒中防腐剂脱氢乙酸（DHA）的方法。采用甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（体积比=20∶80，pH=7.5~8.5）作为流动相，流速为0.25 mL/min，柱温为35℃，检测波长为293nm。该方法以保留时间（Rt）定性，外标法定量，在5.0 mg/L~200.0 mg/L范围内待测组分的峰面积与浓度有良好的线性关系，R2>0.9999，样品在5.0、10.0、25.0mg/L 3个加标水平回收率范围为87.0%~101.2%（n=10），相对标准偏差小于3%，该方法的定量限（LOQ）为5.0mg/L。

关键词：葡萄酒；脱氢乙酸；超高效液相色谱法；二极管阵列检测器

脱氢乙酸（Dehydroacetic acid），别名二乙酰基乙酰乙酸，是一种低毒高效的防腐、防霉剂，防腐效果是苯酸钠的2倍~10倍，在酸、碱条件下均具有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强[1-2]，因此，在食品中常被用作防腐剂、防霉剂[3-4]。但脱氢乙酸因具有一定的毒性，其安全性也受到质疑[5]；我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[6]规定：脱氢乙酸可用于黄油、酱菜、发酵豆制品、面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料、果蔬汁。由于脱氢乙酸在该标准中的使用范围并不包括葡萄酒，因此，脱氢乙酸在葡萄酒中为违规添加剂。目前，一些葡萄酒生产商利用脱氢乙酸良好防腐效果在葡萄酒中违规添加[7-8]，因此，建立葡萄酒中脱氢乙酸的测定方法尤为必要，它可弥补国标方法的不足。目前文献报道的脱氢乙酸检测方法主要有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]，但上述方法存在或前处理复杂、或检测速度慢、或灵敏度不高、或不适于葡萄酒等问题[11-18]；本文建立了采用UPLC快速测定葡萄酒中脱氢乙酸的方法，极大地提高分离效率和分析速度，该方法前处理简单，分析流程短，检出限低，回收率高，可以快速、简便、准确检测葡萄酒中的脱氢乙酸。

1材料与方法

1.1仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（PDA）：美国Waters公司；MILLI-Q纯水仪：MILLIPOR公司；8893E-TDH超声波萃取仪：美国科尔帕默公司。

1.2试剂

甲醇（色谱纯）：北京迪马科技；脱氢乙酸标准品（纯度99.9 %）：CHEM SRVICE公司；乙酸铵、氨水、氢氧化钠（均为优级纯）：天津化学试剂二厂。

1.3方法

1.3.1样液的制备

取一定的葡萄酒样品，超声波10 min或水浴加热5 min冷却，再取1.0 mL样液用流动相对倍稀释，混匀，定容液过0.45 μm水系滤膜，进UPLC分析测定。

1.3.2超高效液相色谱条件

色谱柱：Waters公司，C18柱，1.7μm，2.1mm×100mm，或相当者；流动相：甲醇∶0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH= 7.5~8.5）=20∶80；恒流速：0.25 mL/min；柱温：35℃；进样量：1.0 μL；波长：293 nm。

1.3.3分析测定

根据样液中被测组分的含量，选择线性范围内的曲线点，依Rt结合PDA光谱图定性、峰面积定量，在1.3.2色谱条件下，DHA标准溶液色谱图见图1、阳性样品色谱图见图2。

图1 5.0 mg/L的DHA标准溶液色谱图Fig.1 5.0 mg/mL DHA standard

图2 24.5 mg/L的DHA葡萄酒样品色谱图Fig.2 24.5 mg/L DHA sample standeard addition

2结果与讨论

2.1前处理方法的优化

本论文对文献报道[6，9]的脱氢乙酸前处理方法进行研究，发现大部分试验针对高蛋白样品，用氢氧化钠溶液提取样品中脱氢乙酸，再经脱脂、去蛋白处理后经高效液相色谱紫外检测器测定，而此类方法操作复杂，不适用于基质简单的酒类产品中脱氢乙酸的检测。研究还发现去除葡萄酒中乙醇和气泡主要有加热法、微波法两种方法[7，13]。本试验采用上述两种方式，对去除的时间和去除效果的进行观察，研究表明：水浴加热5 min和微波提取10 min对脱氢乙酸的测定结果无显著性差异。

2.2色谱柱的选择

根据色谱柱类型不同，本文分别选取①C18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，②C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，③C8，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，④C8，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，4种色谱柱，研究其对测定结果的影响。研究表明：与C18柱相比，C8柱对脱氢乙酸分离度较差，而在长度为50 mm的色谱柱下脱氢乙酸出峰时间较快，不能与溶剂峰很好的分离。因此，选用C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm的色谱柱能得到较好的试验结果。

2.3流动相的pH对分离效果的影响

根据脱氢乙酸的理化特性，本文研究了流动相在pH =3.0~4.5、pH =4.5~6.0、pH =6.0~7.5、pH =7.5~8.5条件下对测定结果的影响，研究表明：pH =3.0~4.5、pH = 4.5~6.0 2个酸度条件下脱氢乙酸容易电离，出现拖尾峰，而pH =6.0~7.0和pH =7.5~8.5时脱氢乙酸不易电离，峰形呈均匀的正态分布，在考虑色谱柱的寿命、分离效果以及脱氢乙酸在弱碱性条件下有较好的溶解性，本试验选择将流动相pH=7.5~8.5范围内进行测定。

2.4方法的回收率与精密度

按照1.3.1方法操作，在5.0、10.0、25.0 mg/L 3个加标水平下进行加标回收试验，结果平均回收率87.0 %~ 101.2 %（n=10），精密度小于3.0 %，方法的稳定性良好，结果见表1。

2.5标准曲线及线性关系

取脱氢乙酸标准溶液，用流动相稀释成浓度在5.0 mg/L~200.0 mg/L的范围内，按照本方法色谱条件分析测定，绘制标准曲线，脱氢乙酸在上述浓度范围内有良好线性关系，线性方程为Y=1.33×104X-3.55× 103，其相关系数R2大于0.999 9。

2.6方法的检出限

按上述样品制备方法，在一系列样品中加入脱氢乙酸标液后，由高浓度到低浓度依次用空白样液逐级稀释，混匀、定容。按照本试验方法和色谱条件分析测定，根据选择合适的噪比S/N=10时的加标浓度计算本方法的定量限（LOQ）值为5.0 mg/L。

表1方法的灵敏度、线性关系及回收率（n=10）Table 1 Sensitivities，linearships and recoveries of the method（n=10）

2.7方法的抗干扰能力研究

为了确定本方法的抗干扰能力，采用在葡萄酒样品中添加一定量且有可能添加的苯甲酸、山梨酸、胭脂红、苋菜红、诱惑红、偶氮红，按照上述方法进行分析测定，结果显示，上述添加剂均不干扰脱氢乙酸的测定。

2.8方法的适用性

分别选取进口和超市购买的常见品牌的干红、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒样品，按照本方法条件进行测试，结果显示在各类型葡萄酒中脱氢乙酸的色谱峰分离度和重现性均较好，符合分析方法的要求，因此，本研究建立的方法适用于多种类型的葡萄酒中脱氢乙酸的测定。

3　结论

本文研究的检测脱氢乙酸方法在5.0 mg/L~ 200.0 mg/L的浓度范围内，有良好的线性关系，相关系数大于0.999 9；样品在5.0、10.0、25.0 mg/L 3个加标水平内的回收率范围为87.0 %~101.2 %，相对标准偏差小于3 %；方法的定性检出限（LOD）为2.0 mg/ L、定量检出限（LOQ）为5.0 mg/L，符合色谱分析的方法要求。本研究方法具有操作简单、快速、灵敏、不需要SPE净化柱和昂贵的质谱设备，便于推广与应用。

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Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）Method for Determination of Dehydroacetic Acid（DHA）in Wine

YU Zi-xuan，YANG Shuang，GE Bao-kun*，SONG Xu
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：A method was developed for the rapid determination of dehydroacetic acid（DHA）in wine . The sample was tested by ultra performance liquid chromatography（UPLC）with diode array detector（PDA）. The mobile phase was methanol-0.02 mol/LAmmonium acetate（mL∶mL=20∶80，pH=7.5-8.5），flow rate was 0.25 mL/min，column temperature was 35℃，determine wavelength was 293 nm. The method for qualitative analysis was based on retention time. And external standard method was used for calculation. Good linear relationship was achieved in the range of 5.0 mg/L-200.0 mg/L for DHA with correlation coefficients above 0.999 9. The recoveries of the method ranged from 87.0 % -101.2 %（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）less than 3 % at 3 spiked levels of 5.0，10.0，25.0 mg/L. The limit of quantification（LOQ）was 5.0 mg/L for DHA.

Key words：wine；DHA；UPLC；PDA

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.040

*通信作者：葛宝坤（1968—），男（汉），研究员，致力于食品安全与残留检测技术。

作者简介：俞子萱（1990—），女（蒙古），助理工程师，本科，研究方向：进出口酒类安全检测技术。