金黄色葡萄球菌分离株自动化核糖体分型的研究

刘培，彭杨思，赵良娟，张霞，庞璐，宋喆，张海英，吴冬雪，高旗利，郑文杰（天津出入境检验检疫局，天津300461）



金黄色葡萄球菌分离株自动化核糖体分型的研究

刘培，彭杨思，赵良娟，张霞，庞璐，宋喆，张海英，吴冬雪，高旗利，郑文杰
（天津出入境检验检疫局，天津300461）

摘要：运用自动化核糖体基因分型系统（Riboprinter），用EcoRI酶，对实验室分离的31株金黄色葡萄球菌进行分子分型研究。31株菌均被鉴定为金黄色葡萄球菌，并获得25种Riboprinter核糖体基因条带型。

关键词：金黄色葡萄球菌；杜邦全自动微生物基因指纹鉴定系统；核糖体基因分型

金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylo-coccus），有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染[1]。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。

随着分子生物学技术的迅速发展，尤其随着众多微生物基因组全序列测序的完成，细菌分型的生物学技术研究取得了广泛的发展。美国等发达国家早在20世纪90年代开始就使用多种分子生物学技术对细菌进行分型研究。其中结合稀有内切酶限制性切割染色体技术和分析酵母核型的改良凝胶电泳技术的脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法、Mazurek等建立的低频限制性切割位点聚合酶链式反应（IRS-PCR）分型方法、Welsh和Williams等利用一种分子遗传标记技术建立的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分型方法、由荷兰Keygene公司的Marc和Pieter发明创建的扩增片段长度多态性（AFLP）分型方法、Harris等建立的基于分离株的同工酶的多态性进行分型的多位点酶电泳（MLEE）分型方法和由MLEE衍生出来多位点测序（MLST）分型方法等分子生物学技术得到广泛应用[2]。这些技术各有特色，各有利弊。其中，AFLP和RFLP的重复性较差，不利于实验室间交流共享数据。MLST依赖基因测序，方法成本较高。PFGE应用最为广泛，其分辨力也很高，但比较费时，在某种程度上限制了PFGE的技术优势[3]。核糖体分型技术利用细菌核糖体基因在进化中比较保守的原理，采用限制性内切酶对细菌基因组进行消化，经电泳转移到膜上，再用核糖体基因探针进行Southern杂交，得到细菌的特异性图谱，具有较好的分型结果[4]。Riboprinter是一种全自动核糖体分型仪器，操作程序化，自动分析能力强，正常情况下，可在8 h内同时完成8个细菌的核糖体分型。

本研究共采用来自不同国家样品中分离出来的金黄色葡萄球菌菌株31株进行了自动化核糖体分型，初步建立了实验室金黄色葡萄球菌核糖体分型数据库。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂

31株试验菌株（见表1）；7.5 %氯化钠肉汤、CM304冻干血浆：陆桥；哥伦比亚琼脂、Baird-Parker琼脂平板：OXOID；VITEK 2 Compact GP卡片：法国梅里埃公司；Riboprinter试剂盒EcoRI试剂套装：美国杜邦公司。

表1试验菌株Table 1 Testing strains

1.2主要仪器与设备

Riboprinter系统：美国杜邦公司；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统：法国梅里埃公司；BioNumerics数据库软件5.0：APPLIED MATHS公司；常规培养法必备的仪器设备和器具。

1.3目标菌Riboprinter核糖体自动分型

根据GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》对试验用31株目标菌进行增菌培养，在Baird-Parker琼脂平板上挑取灰黑色带透明光环菌落，接种营养琼脂，挑取营养琼脂上的菌落进行Riboprinter鉴定。向微量离心管中加入40 μL样本缓冲液，用菌落采集棒接触菌苔，采集细菌放入样本缓冲液中，制成均匀菌悬液。向样本盛放管中加入制备好的菌悬液30 μL，放入配套热处理仪灭活处理约30 min。向热处理好的样本中加入裂解液A和裂解液B各5 μL，制成上样液。按仪器操作要求进行程序自检，输入参数，按程序提示在指定位置安装酶管（EcoRI）、尼龙膜、1 %琼脂糖凝胶盒、基质盒、纯净水、样品盛放管，执行启动程序。

2结果与分析

自动化的Riboprinter过程从细胞裂解、释放细菌DNA开始，之后经限制性内切酶将DNA切成大小一般为2 kb～20 kb的片段，这些片段经琼脂糖凝胶电泳分离并转移至尼龙膜上，在膜上和化学发光物质标记的包含编码16SrRNA和23SrRNA的DNA片段及间隔序列的DNA探针杂交，杂交后得到细菌核糖体指纹图谱，数码相机捕捉特征性的发射光形成图像数据，即Riboprinter条带。在对原始图谱进行标准化分析处理后，以0.85的相似度为界，与RiboPrinter菌库内的ATCC标准菌株谱图进行对比，当样品的图谱与数据库中标准谱图相似程度大于等于0.85时，系统给出结果；如果样品的谱图不能与数据库中标准谱图的任何RiboPrinter模式相似程度大于等于0.85时，系统不能给出结果。整个自动化过程需8 h。

本研究选用EcoRI酶，通过Riboprinter系统，对31株菌进行了核糖体基因分型过程，每个菌株都获得了特征性条带型，将每个菌株产生的条带型与杜邦（DuPont）鉴定数据库中的金黄色葡萄球菌条带型比较，系统判定31株测试菌株全部为金黄色葡萄球菌。比较分析测试菌株时，若两株菌的条带型相似度≥0.90，系统不能区分而自动将其归为同一核糖体基因型组（RiboGroup），并将该核糖体基因型组与杜邦数据库中的标准条带型比较，给出最相似（相似度阈值≥0.85）杜邦条带型。本研究中，31个测试菌株共产生25个核糖体基因型组（RiboGroup）。这25个组分别于数据库中的DUP-15475、DUP-20338、DUP-20341、DUP-4008、DUP -15500、DUP -4073、DUP -15257、DUP -19244、DUP -14190、DUP -14159、DUP -22308、DUP -4067、DUP -19335、DUP -4014、DUP -4029、DUP -18720、DUP-14200、DUP-4036、DUP-4020相似。其中2株金黄色葡萄球菌集中于EcoRI 229-432-S-1组，与数据库中的DUP-15475相似度达0.85～0.87；另8株金黄色葡萄球菌产生4个核糖体基因型组，都与数据库中的DUP-20338相似；3株金黄色葡萄球菌产生2个核糖体基因型组，都与数据库中的DUP-20341相似；2株金黄色葡萄球菌产生2个核糖体基因型组，都与数据库中的DUP-4008相似；另2株金黄色葡萄球菌产生2个核糖体基因型组，都与数据库中的DUP-15500相似；其余条带型都只包含1个菌株，31株金黄色葡萄球菌的核糖体分型结果见表2。

表2 31株金黄色葡萄球菌的核糖体分型结果Table 1 31 Staphylococcus aureus Strains rDNA ribotyping

获得的核糖体指纹图谱经RiboprinterTM标准化后，使用BioNumerics数据库软件进行处理，识别图形条带，确定条带位置，必要时进行手工校正。以BioN－umerics软件分析Dice相关系数并绘制树状图见图1。条带位置差异容许度和优化度分别设为1.00和0.50。对核糖体谱型的聚类分析发现，相似度界限值对分型的范围和数量影响很大。相似度界限值越大，菌株核糖体的型别越多，目前尚无统一的国际标准。Connie S 和Sylvain Brisse在对屎肠球菌（Enterococcus faecium）进行的分型研究，以及Wong等对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的研究中均采用了93 %的相似度；Jaiier G对氏菌进行分型研究时采用了90 %的相似度。本研究借鉴Connie S等的研究，采用93 %的相似度为分型界限值。从图1可见共有21种核糖体带型，其中14种带型分别对应1株金黄色葡萄球菌试验菌株，即Staphylococcus aureus111019、Staphylococcus aureus 091222、Staphylococcus aureus 111128、Staphylococcus aureus 080425、Staphylococcus aureus 090727、Staphylococcus aureus 601004、Staphylococcus aureus601002、Staphylococcus aureus 601001、Staphylococcus aureus 601003、Staphylococcus aureus 120401、Staphylococcus aureus 111108、CMCC26003、Staphylococcus aureus 601009、Staphylococcus aureus 080416；其中1种条带对应5株金黄色葡萄球菌试验菌株，分别为Staphylococcus aureus 601005、Staphylococcus aureus 601007、Staphylococcus aureus 080627、Staphylococcus aureus 080619和Staphylococcus aureus 080301；另6种条带各对应2株金黄色葡萄球菌试验菌株，分别为Staphylococcus aureus 080826和Staphylococcus aureus 101223、Staphylococcus aureus 110922和Staphylococcus aureus 601008、Staphylococcus aureus 060429和Staphylococcus aureus 110314、Staphylococcus aureus 120530 -S1B和Staphylococcus aureus 120531 -S3A、Staphylococcus aureus 601006和Staphylococcus aureus 1320725、Staphylococcus aureus 090907和Staphylococcus aureus 080528。所有菌株的核糖体DNA被限制性内切酶EcoRI消化后条带数为9个左右，酶切条带分子量范围位于1 kb～50 kb之间。

图1 31株金黄色葡萄球菌分离株核糖体型分型树状图Fig.1 Genetic relationships of Staphylococcus aureus from different regions

3　结论

通过试验建立了31株菌，共25个核糖体型的金黄色葡萄球菌核糖体分型数据库。本研究为建立金黄色葡萄球菌分离株自动化核糖体分型积累了一定的数据和经验，但要为突发性食物中毒的诊断和为企业查找污染源进行溯源提供有效信息，还待今后坚持长期连续收集菌株，分析不同来源地的菌株的核糖体基因型分布特征。

参考文献：

[1] Rodrigue D C, Tauxe R V, Rowe B. International increase in Salmonella enteritidis: a new pandemic[J]. Epidemiol Infect, 1990, 105(1):21-27

[2] Iversen C, Waddington M, On S L, et al. Identification and phylogeny of Enterobacter sakazakii relative to Enterobacter and Citrobacter species[J]. Clin Microbiol, 2004,42(11):5368-5370

[3]刘秀梅,陈艳,樊永祥,等. 2003年中国食源性疾病暴发的检测资料分析[J].卫生研究,2006,35(2):201-204

[4] Inglis T J,O’Reilly L,Foster N,et al. Comparison of rapid,automated ribotyping and DNA macrorestriction analysis of Burkholderia pseudomaller[J]. J Clin Microbilo,2002,40(9):3198-3203

Automated Ribotyping of Staphylococcus aureus Monocytogenes

LIU Pei，PENG Yang-si，ZHAO Liang-juan，ZHANG Xia，PANG Lu，SONG Zhe，ZHANG Hai-ying，WU Dong-xue，GAO Qi-li，ZHENG Wen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：31 Staphylococcus aureus strains were tested by the automated ribotyping system（Riboprinter）. All the strains were identified as Staphylococcus aureus by the Riboprinter system，and 25 groups of Riboprint patterns were got.

Key words：Staphylococcus aureus；Riboprinter；ribotyping

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.032

作者简介：刘培（1979—），女（回），高级工程师，硕士研究生，研究方向：食源性微生物检测。

基金项目：国家质检总局科研项目《生态港外来有害动植物疫病及食源性致病菌风险控制措施研究》资助（2014IK222）