黑果枸杞果实提取物的抑菌效果研究

向延菊，白红进，张美娥，朱丽霞，*（.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）



黑果枸杞果实提取物的抑菌效果研究

向延菊1，2，白红进1，张美娥1，朱丽霞1，2，*
（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

摘要：以野生黑果枸杞果实为原料，分别用95%乙醇和水浸提黑果枸杞果实中的抑菌成分，研究黑果枸杞提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母6种菌的抑菌效果，并用抑菌效果较好的醇提液进行供试菌的最小抑菌浓度试验；研究pH、温度对提取液抑菌效果的影响。结果表明：黑果枸杞的醇提液和水提液均对以上细菌、霉菌、酵母菌有一定的抑菌效果，且对细菌的抑菌效果优于霉菌和酵母菌；醇提液的抑菌效果比水提液的抑菌效果好；醇提液对不同菌种的最小抑菌浓度有所不同，其中对黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌浓度是1g/mL，对青霉的最小抑菌浓度是0.5 g/mL，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度是0.125 g/mL，而对金黄色葡萄球菌的是0.062 5 g/mL；提取液在酸性条件下抑菌效果显著，高温长时间处理可降低其抑菌活性。

关键词：黑果枸杞；抑菌性；稳定性

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）系茄科枸杞属多年生灌木植物，分布于山西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等省[1]；其中，我国新疆、甘肃分布较多，且主要分布于新疆塔里木下游地区，属于典型的荒漠植物[2]，而甘肃则主要分布于河西走廊地区、黑河流域沿岸及其湿地地区。黑果枸杞果实在藏药中称“旁玛”，根据《晶珠本草》记载，黑果枸杞味甘、性平、清心热、用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症。据《维吾尔药志》记载，维吾尔医生常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症，民间作滋补强壮以及降压药[3]。黑果枸杞果实含有大量人体所需的氨基酸、微量元素、维生素及β-胡萝卜素等成分[4-5]，其营养成分与宁夏枸杞相似[6]。李进、李彩霞、汪河滨[7-9]等研究发现黑果枸杞提取物和黑果枸杞色素在一定浓度范围内具有抗氧化活性。但鲜见有黑果枸杞果实提取物的抑菌性报道。本研究用95 %乙醇和水浸提黑果枸杞中的抑菌成分，研究黑果枸杞提取液对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌效果、pH、温度对其提取液抑菌效果的影响，以期探索黑果枸杞作为药品、功能食品的成效，为其进一步综合利用提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

黑果枸杞：采自新疆阿拉尔市塔里木河畔。采收当日从枝上剪下，置于通风处自然阴干。95 %乙醇、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、蔗糖：均为国产AR级分析纯；琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨：均为国产RC级分析纯；PDA培养基：用于霉菌和酵母菌的培养；牛肉膏蛋白胨培养基：用于细菌的培养。

1.2供试菌种

细菌：金黄色葡萄球菌（StapHylocus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、大肠杆菌（Eschefichiacoli）；霉菌：青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillus niger）；酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）。所有菌种均来自于塔里木盆地生物资源保护利用省部共建重点实验室的微生物研究室。

1.3仪器与设备

SPX-250C恒温恒湿培养箱、HPX-9272MBE数显电热培养箱、SW-CJ-1F超净工作台：上海博讯实业有限公司；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DL-1电子万用炉、101-5ARS电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；RC2电磁加热器：意大利VELP；XW-80A微型旋窝混合仪：上海沪西分析仪器有限责任公司；DZKW-S-6电热恒温不锈钢水浴锅：巩义英峪予华仪器厂。

1.4方法

1.4.1黑果枸杞水提液的制备方法

取洗净晾干的样品50 g充分破碎后盛于烧杯中，按固液比1∶5（g/mL）加入蒸馏水，于25℃左右浸提12 h后移取上清液待用，再加入蒸馏水冷浸，如此反复3次，将3次所得浸提液合并，于40℃水浴浓缩，加蒸馏水定容至50 mL，得质量浓度为1 g/mL的黑果枸杞水提浸提液。

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1.4.2黑果枸杞醇提液的制备方法

取洗净晾干的样品50 g充分破碎后盛于烧杯中，按固液比1∶5（g/mL）加入95 %的乙醇，于25℃左右浸提12 h后移取上清液待用，再加入乙醇冷浸，反复3次，将3次所得浸提液混合，真空浓缩，得到一定体积的浓缩液，加95 %的乙醇并定容至50 mL，得到质量浓度为1 g/mL的黑果枸杞乙醇提取液。

1.4.3菌种的活化及菌悬液的制备方法

1）菌种的活化

预先将供试菌用适宜的培养基进行活化，细菌在37℃培养24 h，霉菌和酵母菌在28℃培养48 h～72 h。

2）菌悬液的制备

在超净工作台内取无菌水4.5 mL于试管中，将活化好的菌种用接种环挑取1环～2环放入无菌水中，充分振荡。

1.4.4.1黑果枸杞的抑菌效果研究方法—滤纸片法

将滤纸制成6 mm的滤纸片，用报纸包上于170℃杀菌2 h。再用无菌镊子夹取相同数量的滤纸片置于含有相同体积的提取液的培养皿中，浸泡30 min后倒出提取液，在超净工作台上吹干滤纸片。吸取0.1 mL的菌悬液于灭菌后的培养皿中，然后将冷却至约50℃的培养基倒入上述平皿中，每皿15 mL，充分混匀。将吹干的滤纸片用无菌镊子放在供试菌的培养基上，每皿3片，呈正三角形。然后放入培养箱中培养（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培养48 h以外，其余细菌均采用37℃培养24 h），待培养时间到后，观察菌种的生长情况，测定抑菌圈的直径。

1.4.4.2最小抑菌浓度的确定

在无菌条件下，将抑菌效果最好的醇提取原液（质量浓度为1 g/mL）用无菌水稀释得浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 63 g/mL的乙醇提取液；在无菌培养皿中分别加入1 mL不同浓度的稀释液，然后倒入15mL培养基充分混匀，待其凝固后吸取0.1 mL供试菌悬液于平板上涂布均匀。放入适宜的培养箱中进行培养（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培养48 h以外，其余细菌均采用37℃培养24 h），待培养时间到后，观察菌种的生长情况。

1.4.4.3 pH对黑果枸杞提取液抑菌效果的影响

选取同一供试菌种，在无菌培养皿中分别加入1mL pH为3、4、5、6、7、8、9的最低抑菌浓度下的提取液，再倒入15 mL培养基充分混匀，待其凝固后吸取0.1 mL供试菌悬液于平板上涂布均匀。放入适宜的培养箱中进行培养（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培养48 h以外，其余细菌均采用37℃培养24 h），待培养时间到后，观察菌种的生长情况。

1.4.4.4温度对黑果枸杞提取液抑菌活性的影响

在无菌培养皿中分别加入1 mL经60、80、100、121℃热处理15 min的最低抑菌浓度下的提取液，再倒入15 mL培养基充分混匀，待其凝固后吸取0.1 ml供试菌悬液于平板上涂布均匀。放入适宜的培养箱中进行培养（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培养48 h以外，其余细菌均采用37℃培养24 h），待培养时间到后，观察菌种的生长情况。

2结果与分析

2.1不同溶剂提取液抑菌效果比较

移取0.1 mL的供试菌种的菌悬液于平皿中，加入15 mL培养基，充分混匀，待冷却凝固后，将已灭菌的滤纸片放入浸提液中浸泡30 min后于超净工作台吹干，将滤纸片放在含有供试菌种的培养基上，置于培养箱中培养，试验结果见表1。

表1黑果枸杞提取液对供试菌的抑菌圈直径Table 1 Diameter of inhibition zone of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr. acting on the selected bacteriamm

从表1可知，黑果枸杞的水提液、乙醇提取液对细菌、酵母、霉菌都有一定的抑菌效果。95 %乙醇提取液的抑菌效果优于水提液；两种提取液对5种微生物的抑菌效果顺序依次为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞青霉＞黑曲霉＞啤酒酵母，且两种提取液均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较好的抑菌效果。

2.2醇提液对各种菌的最小抑菌浓度

依据2.1试验结果，选择抑菌效果较好的醇提液做最小抑菌浓度试验，试验结果见表2。

由表2可知，黑果枸杞醇提液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度是0.125 g/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是0.062 5 g/mL，对黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌浓度是1 g/mL，对青霉的最小抑菌浓度是0.5 g/mL。本试验进一步说明黑果枸杞提取液对细菌的抑菌效果要比对霉菌的抑菌效果要好，其中，对金黄色葡萄球菌有最好的抑菌效果。

表2黑果枸杞醇提液对供试菌种的最小抑菌浓度Table 2 The minimum antibacterial concentration of ethanol extract of Lycium ruthenicum Murr. acting on the selected bacteria

2.3 pH对黑果枸杞提取液抑菌作用的影响

以抑菌效果较好的细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）作为测试菌种，调节最低抑菌浓度下提取液的pH，观察其对黑果枸杞提取液的抑菌效果的影响，结果见表3。

表3 pH对黑果枸杞提取液液抑菌活性的影响Table 3 The influence of pH value on antibacterial activity of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr.

从表3可知，黑果枸杞提取液在酸性及中性条件下有较好的抑菌活性，尤以pH≤6时抑菌效果较好。由于在酸性条件下能引起非极性酚类化合物上所带酚羟基电离度变小，疏水性增强，酚类等更易溶于细胞膜的脂相及蛋白质的疏水区域，因而降低pH，抑菌效果好。

2.4温度对黑果枸杞提取液抑菌活性的影响

将最低抑菌浓度下的提取液分别置于60、80、100、121℃热处理15 min，选取同一供试菌种经过上述处理（操作方法与最小抑菌浓度的测定方法相同），得温度对黑果枸杞提取液抑菌活性的影响结果见表4。

从表4可知，较低温度（60、80℃）处理对黑果枸杞提取液的抑菌效果无影响，其热稳定性较好，100℃以上长时间处理后其抑菌效果不明显。可能是高温使提取液中的抑菌物质发生了物理或化学变化而使其抑菌活性下降。

表4温度对黑果枸杞提取液抑菌活性的影响Table 4 The influence of temperature on antibacterial activity of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr.

3　结论

本研究以塔里木河畔野生黑果枸杞为研究对象，用水提法和醇提法（95 %的乙醇）提取黑果枸杞中的抑菌成分，对供试菌种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母等进行抑菌试验和稳定性的研究，结果表明：

1）同一菌种在不同的浸提条件下抑菌效果有明显差异，同一浸提条件对不同供试菌种也存在着较大差异。其中醇提液（95 %的乙醇）的抑菌效果优于水提液，两种提取方法对各种供试菌的抑菌效果均是细菌＞霉菌＞酵母。对于6种供试菌种，即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母，水提液的抑菌直径分别为20.5、20.05、19.95、9.45、8.55、6.5 mm；醇提液的抑菌圈直径分别为25、24.65、24.55、12.05、10.55、7.45 mm。

2）不同菌种的最小抑菌浓度有所不同，其中黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌浓度是1 g/mL，青霉的最小抑菌浓度是0.5 g/mL，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的是0.125 g/mL，金黄色葡萄球菌的是0.062 5 g/mL。

3）黑果枸杞提取物的抑菌圈大小与其相应的最小抑菌浓度（MIC）值不一定成正相关关系。黑果枸杞95 %醇提液对大肠杆菌的抑菌圈直径（25 mm）大于金黄色葡萄球菌（24.65 mm），但是醇提液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.062 5 g/mL，此值却小于大肠杆菌的最小浓度0.125 g/mL。

4）酸性条件下，黑果枸杞提取液抑菌效果较显著，有较好的抑菌活性；pH＜6时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果均显著。黑果枸杞提取液经过热处理时，在100℃以下时热稳定性很好，抑菌效果明显；在超过100℃时抑菌效果不明显。

参考文献：

[1]匡可任,路安民.中国植物志[M].北京:科学出版社, 1978: 10

[2]张绘芳,李霞,王建刚,等.塔里木河下游植物群落结构特征分析[J].生态环境, 2007,16(4): 1219-1224

[3]甘青梅,左振常,昌也平,等.藏药“旁玛”的考证及生药学研究[J].中国民族民间医药杂志, 1995(1): 31-33

[4]陈红军,马玲,孔星云.黑果枸杞中十三种元素含量的测定[J].中国野生植物资源, 2002, 21(4): 59-60

[5]陈红军,侯旭杰,白红进,等.黑果枸杞中的几种营养成分的分析[J].中国野生植物资源, 2002, 21(2):55

[6]甘青梅.浅述藏药的研究[J].中草药, 2001, 32(4): 371-373

[7]李进,瞿伟菁,张素军,等.黑果枸杞色素的抗氧化活性研究[J].中国中药杂志, 2006(14): 1179-1183

[8]李彩霞,焦扬,梁倩倩,等.黑果枸杞提取物抗氧化性研究[J].食品工业科技, 2006, 27(10):55-57

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Study on Antibacterial Activity of Extracting Solution of Fruits of Lycium ruthenicum Murr.

XIANG Yan-ju1，2，BAI Hong-jin1，ZHANG Mei-e1，ZHU Li-xia1，2，*
（1. College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2. Xinjiang Production & Construction Corp Key Laboratory for Advanced Processing of Southern Xinjiang Local Agricultural Products，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract：Antibacterial activity of extracting solution，which was extracted from fruits of Lycium ruthenicum Murr. using 95 % ethanol and water respectively as solvent，on testing microorganisms that were Eschefichia coli，StapHylocus aureus，Bacillus subtilis，Penicillium，Spergillus nigercans，Saccharomyces cerevisiae Hansen was discussed. Extracting solution with 95 % ethanol that had better antibacterial activity than one with water was used to do experiments of the minimum bacteriostasis concentration of extraction on six kinds of microorganisms. The influence of pH value and temperature on the antibacterial activity of extracting solution was researched. The results showed，that extracting solution with 95 % ethanol and water had definite antibacterial activity for six kinds of microorganisms，the antibacterial activity of extracting solution for bacteria was better than for mould and yeast，and the antibacterial activity of extracting solution with 95 % ethanol was better than one with water. The minimum antibacterial concentration of ethanol extract of Lycium ruthenicum Murr. acting on Aspergillus niger，Saccharomyces cerevisiae Hansen，Penicillium，Eschefichia coli，Bacillus subtilis，and StapHylocus aureus were 1 g/mL，1 g/mL，0.5 g/mL，0.125 g/mL，0.125 g/mL and 0.062 5 g/mL respectively. Extracting solution of Lycium ruthenicum Murr had better antibacterial activity under acid condition and lower one under high temperature for a long time treatment.

Key words：Lycium ruthenicum Murr.；antibacterial activity；stability

收稿日期：2014-08-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.007

*通信作者：朱丽霞（1975—），女，副教授，硕士，研究方向：食品微生物及传统发酵食品。

作者简介：向延菊（1970—），女（土家），副教授，硕士，研究方向：园艺产品贮藏与加工。

基金项目：新疆生产建设兵团高新技术研究发展计划《黑果枸杞活性成分的提取及其产品开发》（2007GX20）