黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌抑菌效果的研究

何晓辉, 王立霞，方 琴，王俊刚，申 红

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2. 石河子大学农学院，新疆石河子 832003)



黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌抑菌效果的研究

何晓辉1, 王立霞1，方 琴1，王俊刚2，申 红1

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2. 石河子大学农学院，新疆石河子 832003)

摘要：【目的】探究黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌抑菌效果。【方法】用浓度为1×108CFU/mL的粪肠球菌菌液与麸皮混合饲喂诱导黄粉虫幼虫，在24 h后提取黄粉虫抗菌肽，用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定黄粉虫抗菌肽粗提液浓度，采用试管稀释法测定青霉素、庆大霉素对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)，用多步诱导法筛选出青霉素和庆大霉素耐药的粪肠球菌，用Kirby Bauer法测定黄粉虫抗菌肽对耐青霉素和庆大霉素的粪肠球菌的抑菌活性。【结果】经粪肠球菌诱导24 h后提取的黄粉虫抗菌肽浓度,显著高于未用粪肠球菌诱导的对照组(P<0.05)，其抑菌活性也显著高于对照组(P<0.05)，并且诱导黄粉虫抗菌肽组对耐青霉素、庆大霉素粪肠球菌的抑菌效果显著高于抗生素组(P<0.05)。【结论】黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌具有显著的抑菌效果。

关键词：黄粉虫；粪肠球菌；抗菌肽；耐药菌；抑菌

0引 言

【研究意义】抗生素作为饲料添加剂以及在临床治疗疾病中长期大剂量的使用，会使畜禽逐渐对各类抗菌药物产生依赖性，导致畜禽体内菌群失调。同时，抗生素进入机体后短时间内不能完全代谢排出体外，容易蓄积在动物体内，就会造成动物性产品的污染。含有抗生素残留的肉、奶、蛋、鱼等动物性食品若被食用，一般情况下不会表现出急性中毒症状，但长时间摄入含有抗生素残留的动物性食品，就会造成抗生素在人体内某些器官和组织蓄积，引起相应的病变，甚至会发生癌变[1]。科研人员一直致力于探寻一种安全可靠且经济的新型抗菌药物，来缓解由抗生素引起的种种不利局面，昆虫抗菌肽便被关注。昆虫抗菌肽作为生物防御系统的一个重要组成部分，是昆虫受到病原微生物感染或损伤的情况下产生的一类具有抗菌活性的物质，这种物质为非专一性免疫应答产物，对细菌、病毒、真菌均具有抑杀作用，尤其是对耐药细菌也具有杀伤作用[2]。【前人研究进展】自Mcon H J等[3]报道黄粉虫通过诱导可以产生抗菌肽后，国内很多学者对黄粉虫体内的抗菌活性物质进行研究，王小平等[4]研究发现，黄粉虫幼虫用大肠杆菌诱导可产生抗菌物质，这种抗菌物质能够对多种植物和动物病原微生物产生抑制作用；韩润林等[5]用超声波和饥饿后饲喂大肠杆菌的方式处理黄粉虫，发现经处理后的黄粉虫产生了具有抗菌活性的抗菌肽。【本研究切入点】肠球菌属(Enterococcus)是医院引起感染的常见病原菌，主要感染对象是过量使用抗生素的患者或免疫力低下的人群，可以引起菌血症、尿道感染、腹腔感染等[6]，也可导致败血症、心内膜炎等疾病的产生甚至可危及生命，死亡率达21.0%～27.5%[7]。粪肠球菌是肠球菌感染的临床分离株中最常见的菌株，由于肠球菌具有天然和获得性耐药的特性，并且新的抗生素开发速度缓慢，在临床治疗由肠球菌引起的感染就变得越来越困难。【拟解决的关键问题】研究以黄粉虫为材料，依据前期研究细菌诱导蝇蛆24 h产生的抗菌肽浓度高和抑菌活性强的基础上，探索用粪肠球菌饲喂诱导黄粉虫产生抗菌肽，对诱导24 h产生的抗菌肽进行粗提并测定其浓度和对耐药粪肠球菌抑菌效果。为黄粉虫抗菌肽治疗耐药性的肠球菌感染疾病和作为新型的绿色抗生素提供科学依据。

1材料与方法

1.1　材 料

黄粉虫幼虫由石河子大学农学院植物保护系生物防治研究室提供；粪肠球菌羔羊分离株由石河子大学动物科技学院微生物实验室提供。

1.2　方 法

1.2.1黄粉虫抗菌肽的诱导

挑选5日龄黄粉虫幼虫300头，随机分成2组(诱导组、对照组)，每组设立3个重复。诱导组(采用浓度为1×108CFU/mL的粪肠球菌菌液30 mL与相同质量的麸皮混合饲喂黄粉虫幼虫)，对照组(用等体积蒸馏水代替菌液与等量麸皮混合饲喂黄粉虫幼虫)。将处理的黄粉虫幼虫置于温度为25～30℃，相对湿度为65%～70%的环境下饲养，24 h后挑取活的黄粉虫虫体，备用。

1.2.2黄粉虫幼虫抗菌肽的粗提

取上述黄粉虫幼虫，先将虫体用自来水冲洗8次，再用蒸馏水冲洗3次，然后用滤纸蘸干虫体，再用75%酒精擦拭虫体消毒。按照虫体质量与提取液体积比为1∶3加入提取液(0.05 mol/L乙酸铵缓冲液，pH=5.0,0.35 g/mL 苯甲基磺酰氟和2‰巯基乙醇)把虫体置于高速组织捣碎机中充分捣碎，收集匀浆液。将匀浆液在12 000 r/min高速冷冻离心机中离心30 min后收集上清液，重复上述步骤3次，然后合并上清液，将上清液置于100℃恒温水浴锅中加热搅拌5 min，然后待其冷却10 min，再吸取上清液在4 800 r/min高速冷冻离心机中离心30 min，最后取离心管上清液(抗菌肽粗提液)置于小试管内保存于-20℃冰箱中，备用[8]。

1.2.3黄粉虫抗菌肽粗提液浓度的测定

用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定[9]。以标准蛋白(结晶牛血清白蛋白)的浓度值(mg/mL)作为横坐标，吸光光度值OD595作为纵坐标作一条标准蛋白曲线。用紫外分光光度计分别测定各组黄粉虫抗菌肽提取液的OD值，然后根据标准蛋白曲线来确定各组抗菌肽提取液的浓度。图1

图1 标准蛋白曲线

Fig.1 Standard protein cure

1.2.4黄粉虫抗菌肽粗提液对粪肠球菌抑菌效果的测定

采用Kirby Bauer法(K-B纸片琼脂扩散法)来确定其抑菌活性。将粪肠球菌用比浊法制备成1×107CFU/mL的菌悬液，取100 L菌悬液用涂布器将菌液均匀涂布于整个BHI培养基表面，反复涂布几次，每次把平板旋转60°，然后将涂布器沿着平板边缘旋转2圈。取直径为6 mm的滤纸片，高压灭菌，然后把滤纸片在各组抗菌肽提取液中浸泡4 min，常温放置3 min，再用无菌镊子夹取滤纸片贴在平板的不同区域内，两纸片之间距离不小于24 mm，纸片距离平板边缘不小于15 mm。然后将平板置于37℃温箱培养18 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.2.5青霉素、庆大霉素对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

采用试管稀释法检测MIC，用BHI肉汤作为培养基，药物稀释倍数依次为：10、20、40和80倍。粪肠球菌作为指示菌种。经肉眼观察，无细菌生长的培养液的最低药物浓度即为该待检药物的MIC。

1.2.6粪肠球菌的青霉素、庆大霉素诱导性耐药试验

采用多步诱导法[10]：将粪肠球菌菌液用比浊法制备成1×107CFU/mL的菌悬液。在5 mL含青霉素(100 mg/mL)的BHI肉汤中加入5 L的菌悬液，利用连续转种的方式培养，37℃培养24 h为1代。药物的浓度从1/4 MIC开始增加，药物浓度依次为：1.25、2.5、5、10…128 g/mL，每个药物浓度培养5代，最终使抗菌药物浓度达到128 g/mL。在诱导过程中如果没有细菌生长则可降低药物浓度培养或同一个浓度反复传代培养。若重复传代5次仍没有细菌生长则终止试验。在将试验菌接种在含青霉素的BHI肉汤的同时，接种等量试验菌在不含青霉素的BHI肉汤中，作为对照，进行同期培养。庆大霉素(50 mg/mL)诱导性耐药试验中只有抗菌药物和浓度不同，其余步骤与青霉素诱导性耐药试验过程相同。将试验菌接种在含有庆大霉素药物浓度逐渐增高的BHI肉汤中，37℃培养18 h后观察。若有细菌生长，则将抗菌药物浓度逐步增加至2 000 g/mL。

1.2.7黄粉虫抗菌肽粗提液对耐药粪肠球菌抑菌效果测定

采用Kirby Bauer法(K-B纸片琼脂扩散法)来确定其抑菌效果。取待检菌液(青霉素耐药粪肠球菌、庆大霉素耐药粪肠球菌)100 μL用涂布器均匀涂布在整个BHI培养基表面。当平板上的水分晾干后，再贴药敏纸片(抗菌肽提取液与抗生素)，每个培养基贴5片，两纸片之间距离不小于24 mm，纸片距离平板边缘不小于15 mm。然后置于恒温箱37℃培养18 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌圈直径判断标准：青霉素药敏纸片(10 g/片)对粪肠球菌的抑菌圈直径≤20 mm为低度敏感；20～29 mm为中度敏感；≥29 mm为高度敏感；庆大霉素药敏纸片(120 g/片)的抑菌圈直径≤12 mm为低度敏感；12～15 mm为中度敏感；≥15 mm为高度敏感；氨苄西林药敏纸片(10 g/片)的抑菌圈直径≤16 mm为低度敏感；16～17 mm为中度敏感；≥17 mm为高度敏感；利福平药敏纸片(5 g/片)的抑菌圈直径≤16 mm为低度敏感；16～20 mm为中度敏感；≥20 mm为高度敏感；四环素药敏纸片(30 g/片)的抑菌圈直径≤14 mm为低度敏感；14～19 mm为中度敏感；≥19 mm为高度敏感。

1.3　数据统计

利用SPSS 17.0统计软件进行显著性检验，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1　粪肠球菌培养的黄粉虫抗菌肽粗提液浓度

试验组粪肠球菌培养的黄粉虫提取抗菌肽并测定其浓度，用麸皮培养24 h后的黄粉虫组抗菌肽粗提液的浓度((0.47±0.01)mg/mL)显著低于粪肠球菌培养的黄粉虫抗菌肽粗提液的浓度(0.92±0.06)mg/mL(P<0.05)，提示粪肠球菌可以有效的刺激黄粉虫产生高表达量的抗菌肽。黄粉虫在一定病原微生物的刺激下能够产生具有免疫作用的高浓度抗菌肽。

表1黄粉虫抗菌肽粗提液对粪肠球菌的抑菌圈直径(mm)
Table 1The inhibition zone diameter of molitor antimicrobial peptides crude extract toEnterococcusfaecalis

组别Group抑菌圈直径(mm)TheInhibitionzonediameter粪肠球菌培养的黄粉虫组GroupofEnterococcusfaecalisbreedingtenebriomolitor13.97±1.87a麸皮培养的黄粉虫组(对照)Groupoftenebriomolitorfedwheatbran(Contrast)10.27±1.03b无菌水组Sterilewater0

注：同列肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同

Note: Values with same capital letters within a column were not highly significant(P>0.05),values with different capital were within a columnwere highly significant(P<0.01), values with different lower case letters indicate significant differences (P<0.05), the same as below

2.2　粪肠球菌培养的黄粉虫抗菌肽粗提液对粪肠球菌抑菌活性

粪肠球菌培养黄粉虫产生的抗菌肽对粪肠球菌的抑菌圈直径显著高于健康生长的黄粉虫抗菌肽(对照组)(P<0.05)，表明细菌诱导黄粉虫不仅能够提高黄粉虫抗菌肽的表达水平而且还能提高黄粉虫抗菌肽的抑菌活性。表1

2.3　筛选抗生素对粪肠球菌最小抑菌浓度(MIC)

用试管稀释法筛选青霉素、庆大霉素对粪肠球菌最小抑菌浓度(MIC)的结果显示，当添加抗生素药液(青霉素、庆大霉素)的初始浓度为50 g/mL时经试管稀释(1∶10)后确定青霉素、庆大霉素对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)值均为5.0 g/mL。依据美国临床标准委员会(2004)NCCLS标准规定，对青霉素敏感的菌株最低抑菌浓度(MIC)<8 g/mL，对庆大霉素敏感的菌株最低抑菌浓度(MIC)<16 g/mL，若抗生素对粪肠球菌最小抑菌浓度(MIC)值大于此标准值即定为对该抗生素耐药。试验中青霉素、庆大霉素对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)值为5.0 g/mL即小于以上判定标准，因此粪肠球菌对这两种抗生素均敏感。

2.4　青霉素、庆大霉素诱导粪肠球菌的耐药性

经抗生素多步诱导法后，根据美国临床标准委员会(2004)NCCLS标准推荐的K-B法进行抗生素多步诱导的耐药试验结果显示，青霉素药敏纸片(10 g/片)对青霉素诱导的粪肠球菌的抑菌圈直径为(13.67±0.24)mm，庆大霉素药敏纸片(120 g/片)对庆大霉素诱导的粪肠球菌的抑菌圈直径为(14.17±0.44)mm，依据抑菌试验判断标准可知，经青霉素、庆大霉素诱导的耐药试验获得的粪肠球菌对青霉素、庆大霉素为中低度敏感即产生了耐药性。

2.5　黄粉虫抗菌肽粗提液对抗生素筛选的耐药的粪肠球菌抑菌活性

用黄粉虫抗菌肽粗提液纸片和抗生素药敏纸片(四环素、利福平和氨苄西林)对青霉素筛选的耐药粪肠球菌进行抑菌活性的检测结果显示，粪肠球菌培养的黄粉虫组的抗菌肽对耐青霉素的粪肠球菌的抑菌活性显著高于氨苄西林组和利福平组(P<0.05)，与四环素组差异不显著(P>0.05)。依据美国临床标准委员会(2004)NCCLS标准推荐的K-B法的判断标准可知，筛选获得的粪肠球菌对氨苄西林、利福平均为低度敏感，而对四环素为高度敏感。

用黄粉虫抗菌肽粗提液纸片和抗生素药敏纸片(四环素、利福平和氨苄西林)对庆大霉素筛选的耐药粪肠球菌进行抑菌活性的检测结果显示，粪肠球菌诱导黄粉虫组抗菌肽粗提液对耐庆大霉素的粪肠球菌的抑菌活性显著高于氨苄西林组和利福平组(P<0.05)，与四环素组差异不显著(P>0.05)。抗生素组的利福平为低度敏感，氨苄西林组对粪肠球菌无抑菌圈产生，表明耐庆大霉素的粪肠球菌对氨苄西林完全耐药。黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌具有较好的抑菌效果。表2

表2 黄粉虫抗菌肽与抗生素对耐药粪肠球菌的抑菌效果
Table 2The antimicrobial effect of molitor antimicrobial peptides crude extract and antibiotic to Enterococcus faecalis

组别Group抑菌圈直径(mm)TheInhibitionzonediameter青霉素耐药粪肠球菌PenicillinresistantEnterococcusfaecalis庆大霉素耐药粪肠球菌GentamicinresistanceinEnterococcusfaecalis粪肠球菌培养的黄粉虫组GroupofEnterococcusfaecalisbreedingTenebriomolitor25.17±0.60a24.57±0.23a氨苄西林组Ampicillingroup8.10±0.97c无抑菌圈出现利福平组Rifampicingroup12.00±1.89b14.83±1.59b四环素组Tetracyclinegroup24.67±1.04a22.43±0.30a

3讨 论

目前，养殖行业滥用各类抗菌药物，引起一些病原微生物产生耐药性，如何解决病原微生物的耐药性这一问题便成为了困扰人们的难题。随着人们对抗菌肽的深入研究以及抗菌肽表现出的诸多优点，使得抗菌肽越来越被关注，抗菌肽是辅助生物机体抵抗外来病原体入侵的重要防御分子，不仅能抑制、杀灭多种细菌，而且还具有抗真菌、病毒等作用，最重要的是不产生耐药性[11]。大量研究报道，通过细菌感染刺激能够诱导并提高昆虫抗菌肽的表达水平。试验采用粪肠球菌菌液与麸皮混合饲喂黄粉虫幼虫，饲喂24 h后，提取的黄粉虫抗菌肽粗提液的抑菌活性的测定结果显示，用粪肠球菌诱导黄粉虫的抗菌肽粗提液的浓度显著高于未诱导的黄粉虫对照组(P<0.05)，提示黄粉虫幼虫为避免致病耐药粪肠球菌的侵染，自身产生了高浓度的抗菌肽，可能是致病细菌引起了黄粉虫的适应性免疫。

随着对抗菌肽更进一步的深入研究，发现昆虫机体内抗菌肽基因表达受到微生物诱导的调控，特定的抗菌肽基因表达是由特定种类的微生物特异地激活，所以表现出不同诱导源诱导的昆虫可以产生不同的抗菌肽，而且产生的抗菌肽抑菌强度也不相同[12]，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、硝酸盐杆菌、致病性大肠杆菌以及高度耐药性细菌菌株均具有抗菌作用[13]。研究发现，粪肠球菌不仅对多种常用抗生素有天然耐药性，而且也可通过突变或接受外源基因而产生获得性耐药[14,15]。试验用试管稀释法获得了青霉素、庆大霉素对粪肠球菌的最小抑菌浓度(MIC)值均为5.0 g/mL，然后进行粪肠球菌的青霉素、庆大霉素诱导性耐药试验，筛选获得了对青霉素、庆大霉素产生耐药的粪肠球菌。对青霉素筛选的耐药粪肠球菌的抑菌活性检测结果显示，粪肠球菌对氨苄西林、利福平均为低度敏感，而对黄粉虫抗菌肽和四环素高度敏感(P>0.05)，此结果与Peterson等[16]使用四环素类抗生素对耐四环素的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和淋病奈瑟氏菌等进行抑菌活性比较，结果显示对四环素耐药菌和敏感菌具有相同的抑菌活性的研究结果一致。

黄粉虫抗菌肽粗提液对庆大霉素筛选的耐药粪肠球菌的抑菌活性检测结果显示，抗生素组中利福平为低度敏感，氨苄西林组对粪肠球菌无抑菌圈产生，表明耐庆大霉素的粪肠球菌对氨苄西林完全耐药。而黄粉虫抗菌肽与四环素组高度敏感(P>0.05)。说明黄粉虫抗菌肽和四环素对青霉素和庆大霉素耐药的粪肠球菌具有同样的抑菌效果。

目前已有研究发现，昆虫抗菌肽具有独特的杀菌机理，其主要是作用于细菌的细胞膜，然后破坏其完整性并产生穿孔，从而造成细胞内容物溢出胞外而死亡或抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致细菌死亡，这种独特的杀菌机制对临床上一些常见的耐药性细菌具有良好的应用前景[17,18]。试验通过多步法用抗菌药物对粪肠球菌进行耐药性诱导，在低浓度抗生素的长期作用下，可以诱导粪肠球菌产生获得性耐药。然后通过K-B法进行体外抑菌试验的研究结果发现，粪肠球菌对多种抗生素产生耐药，但黄粉虫抗菌肽对其仍具有一定抑菌效果。

4 结 论

试验通过粪肠球菌刺激诱导黄粉虫24 h后获得粪肠球菌刺激诱导黄粉虫的提取液，黄粉虫提取液不仅具有较高的浓度而且对耐药粪肠球菌具有较好的抑菌效果，可能是黄粉虫针对粪肠球菌的刺激迅速产生了具有抗菌活性的物质，这种机制还有待于在分子水平上做更进一步的研究。黄粉虫是我国饲养量较大的一种资源昆虫，具有很好的应用价值和市场前景。因此，研究通过相关试验为昆虫抗菌肽治疗由耐药性细菌引起的疾病和新型抗菌药物的研发奠定了基础。

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Fund project:Supported by NSFC (31060281 ) and the National SRP (201410759068)

Study of the Effects of Tenebrio Molitor Antimicrobial Peptides Acting on

ResistantEnterococcusfaecalisAntibacterial

HE Xiao-hui1, WANG Li-xia1, FANG Qin1, WANG Jun-gang2, SHEN Hong1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity,ShiheziXingiang832003，China；2.CollegeofAgronomy，ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003，China)

Abstract：【Objective】 In order to explore tenebrio molitor antimicrobial peptides (AMPs) and observe it for resistant Enterococcus faecalis inhibitory effect.【Method】In this experiment, tenebrio molitor larva were fed with concentration of Enterococcus faecalis bacteria 1×108CFU/mL mixed with bran, the AMPs was extracted crudely after 24 h respectively. Crude extract of the antibacterial peptides of tenebrio molitors was detected by Coomassie brilliant blue method. MIC was determined for enterococcus against penicillin and gentamicin by tube broth method. At last enterococcus were screened with multi-step inducing method and the antibacterial activity of peptides were determined by Kirby Bauer method.【Result】The result showed that the value of peptides was obviously higher than these not induced by enterococcus in the control group(P<0.05). The antibacterial activity of peptides was also higher than that of the control group(P<0.05)and antibiotic group(P<0.05).【Conclusion】Antibacterial peptides of tenebrio molitors have a good effect on gentamicin resistant enterococcus .

Key words:tenebrio molitor; Enterococcus faecalis；antimicrobial peptides; resistant bacteria；antibacterial

通讯作者:申红 (1970-)，女，副教授，硕士生导师，研究方向为动物生理生化与分子遗传育种，(E-mail)shenhong98@163.com

作者简介:何晓辉 (1991-)，男，甘肃人，本科生，研究方向为动物医学，(E-mail)1210427624@qq.com

基金项目:国家自然科学基金项目(31060281)；国家SRP资助项目(201410759068)

收稿日期：2015-07-08

中图分类号：S182

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)02-0317-07

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.018