HLA-G慢病毒表达载体的构建及病毒颗粒的包装

廖贵益，钟金彪，赵 飞，朱道方

◇技术与方法◇

HLA-G慢病毒表达载体的构建及病毒颗粒的包装

廖贵益，钟金彪，赵 飞，朱道方

设计合成全长人类白细胞抗原G（HLA-G）基因系列，在克隆质粒pLV-EF1a-EGFP-N的基础上构建HLA-G基因慢病毒表达载体，测序鉴定pLV-EF1a-EGFP-N-HLA-G构建成功。与包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）转染293T包装细胞，包装出高效感染率的慢病毒颗粒，测定病毒滴度为1×109TU/ml。HLA-G慢病毒表达载体的构建及病毒颗粒的包装为转染HLA-G诱导移植肾免疫耐受的研究奠定了基础。

HLA-G；慢病毒；基因工程；免疫耐受

人类白细胞抗原G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）是一种非经典的HLA-I类分子，其编码基因与分子结构与经典HLA-I类分子相似。HLA-G的特点是分子胞内段仅6个氨基酸残基且缺乏经典HLA-I类分子保守的丝氨酸残基，是其高效稳定表达在细胞膜表面的结构基础。1987年Geraghty首次克隆HLA-G基因，其位于6号染色体短臂，编码4种膜结合型HLA-G和2种可溶性HLA-G。各型HLA-G通过不同的机制对细胞免疫反应和体液免疫反应产生全面持久的抑制作用，在胎儿、眼球等免疫赦免区的免疫耐受及肿瘤的免疫逃逸中起着重要作用。利用转基因技术使移植肾表达HLA-G可望建立移植肾的免疫耐受。该实验即构建携带HLAG基因的慢病毒载体，包装慢病毒颗粒，用于后续转染HLA-G基因诱导移植肾免疫耐受的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒、细菌和细胞 携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EF1a-EGFP-N及包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）购自上海吉玛制药技术有限公司；DH5a感受态细菌购自上海TIANGEN公司；293T细胞购自中国科学院上海细胞所。

1.1.2主要试剂 EcoR I、BamH I、T4连接酶和DNA marker购自加拿大MBI Fermentas公司；PCR引物由生工生物工程（上海）公司合成；质粒抽提试剂盒购自上海QIAGEN公司；PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒购自北京英茂盛业生物科技有限公司；RNAi-Mate购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1HLA-G基因的合成 参照GenBank，提交北京英茂盛业生物科技有限公司设计合成全长HLAG基因片段，上游引入EcoR I切点和增强基因表达的Kozak序列（GCCACC），下游引入BamH I切点。

1.2.2克隆载体与HLA-G基因片段的双酶切 用EcoR I、BamH I分别双酶切携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLV-EF1a-EGFP-N（图1）和HLA-G基因片段。HLA-G酶切反应体系：HLA-G 20μl、EcoR I 1.5μl、BamH I 3μl、10×buffer 20μl加ddH2O至100μl。pLV-EF1a-EGFP-N酶切反应体系：pLV-EF1a-EGFP-N 10μl、EcoR I 1.5μl、BamH I 3μl、10×buffer 20μl加ddH2O至100μl。37℃水浴保温4～6 h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并凝胶回收目的条带。

1.2.3HLA-G慢病毒载体构建 将酶切好的HLA-G连接到pLV-EF1a-EGFP-N载体上。连接反应体系：HLA-G 1.5μl、pLV-EF1a-EGFP-N 1μl、10×T4连接buffer 0.5μl、T4连接酶0.5μl、PEG4000 0.5μl加ddH2O至5μl。将连接反应液22℃孵育30 min转化至DH5a感受态，涂于带有Amp抗性的LB培养皿中37℃过夜培养。挑选6个克隆进行PCR阳性筛选，上游引物EF-F：ATTCTCCTTGGAATTTGCCCT；下游引物pEGFP-N-3′：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。将阳性克隆送到擎科新业公司测序备用。

1.2.4慢病毒颗粒包装 293T细胞悬液接种培养皿，10%FBSDMEM、37℃、5%CO2培养过夜。按比例将pLV-EF1a-EGFP-HLA-G和包装质粒（pGag/ Pol、pRev、pVSV-G）加入无血清DMEM离心管。将300μl RNAi-Mate加入另一无血清DMEM离心管。室温放置5 min后两管混合，混合物室温再放置20～25 min。除去293T细胞培养皿中的培养液，加入无血清DMEM培养液，再加入混合物，混匀，37℃5%CO2培养箱中温育4～6 h。吸弃培养液，加入含10%FBS的DMEM培养液，37℃5%CO2继续培养72 h。将培养皿中上清液吸到离心管中，4℃，4 000 r/min离心4 min。将离心管上清液倒入注射器内，用0.45μm过滤器过滤。滤液在离心机中超速离心，4℃，20 000 r/min，2 h。将浓缩的病毒液收集分装，-80℃冰箱保存备用。

1.2.5慢病毒滴度测定 293T细胞培养至90%融合时，倾去培养液，用3 ml D-Hank液洗涤两次。加1 ml Trypsin-EDTA液，混匀，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3～5 min。再加入2 ml含10%FBS的DMEM培养液，吹打使形成单细胞悬液。按3×10细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃5% CO2培养24 h。将慢病毒原液10μl，用10%FBS的DMEM培养液十倍稀释3个～5个梯度。吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃5%CO2培养24 h。吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100μl 10%FBS的DMEM培养液于37℃5%CO2继续培养72 h。通过FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。

2 结果

2.1 HLA-G基因的合成参照GenBank提交的系列，北京英茂盛业生物科技有限公司成功合成全长HLA-G基因片段，并在上游引入EcoR I切点（GAATTC）、增强基因表达的Kozak序列（GCC ACC），在下游引入BamH I切点（GGATCC）。基因系列如下：GAATTC GCCACC ATGGTGGTCATG GCGCCCCGAACCCTCTTCCTGCTGCTCTCGGGGGCC CTGACCCTGACCGAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCC ATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGC CGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTG GACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCG GCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGT GGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGA CACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGA ATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAG AGCGAGGCCAGTTCTCACACCCTCCAGTGGATGATT GGCTGCGACCTGGGGTCCGACGGACGCCTCCTCCGC GGGTATGAACAGTATGCCTACGATGGCAAGGATTAC CTCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCA GCGGACACTGCGGCTCAGATCTCCAAGCGCAAGTGT GAGGCGGCCAATGTGGCTGAACAAAGGAGAGCCTA CCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCACAGAT ACCTGGAGAACGGGAAGGAGATGCTGCAGCGCGCG GACCCCCCCAAGACACACGTGACCCACCACCCTGT CTTTGACTATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCT GGGCTTCTACCCTGCGGAGATCATACTGACCTGGCA GCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACGTGGAGC TCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCC AGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGG AGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGC TGCCGGAGCCCCTCATGCTGAGATGGAAGCAGTCTT CCCTGCCCACCATCCCCATCATGGGTATCGTTGCTGG CCTGGTTGTCCTTGCAGCTGTAGTCACTGGAGCTGCG GTCGCTGCTGTGCTGTGGAGAAAGAAGAGCTCAGAT CGGGATCC。

2.2 克隆载体与HLA-G基因片段的双酶切克隆载体pLV-EF1a-EGFP-N与HLA-G基因片段EcoR I、BamH I双酶切产物凝胶电泳可见大的pLVEF1a-EGFP-N片段（9 419 bp）与小的HLA-G基因片段（1 020 bp）。见图2。

2.3 HLA-G慢病毒载体构建酶切好的HLA-G与pLV-EF1a-EGFP-N进行连接反应。连接反应液转化至DH5a感受态，涂于带有Amp抗性的LB培养皿中培养。PCR筛选挑选阳性克隆。阳性克隆送双向测序，结果与HLA-G基因序列进行比对，显示构建序列与预计碱基序列完全一致并且插入方向正确（图3），携HLA-G基因慢病毒表达载体pLVEF1a-EGFP-N-HLA-G构建成功。

2.4 慢病毒颗粒包装与滴度测定构建的pLVEF1a-EGFP-HLA-G和包装质粒共转染293T细胞，转染后72 h收集细胞培养上清，再以DMEM完全培养液十倍稀释病毒原液4个梯度分别转染293T细胞，培养72 h后通过FACS计数荧光细胞（图4），结合稀释倍数计算病毒滴度为1×109TU/ml，侵染时间均为72 h。

3 讨论

HLA-G特异性表达在妊娠期绒毛膜外细胞滋养层［1-3］、眼球、胸腺髓质间上皮细胞等免疫赦免区，也普遍表达在肿瘤细胞中参与肿瘤的免疫逃逸［4-6］，证实HLA-G是天然存在的、强力的免疫抑制剂。HLA-G能与T、B淋巴细胞、NK细胞和抗原呈递细胞作用产生强效广泛的免疫抑制作用，可望成为诱导免疫耐受的有效靶基因。

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒1，目前被普遍用于研究领域，是基因转染相关研究的有力工具［7］，其能在宿主细胞内以自己的RNA为模板，在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，形成整合前复合体。然后在病毒整合酶的作用下，整合到宿主细胞的染色体上，随宿主细胞染色体的复制表达而复制表达。慢病毒载体与脂质体等其他基因转染方法相比较有多个优点［8-9］：安全性高、转染效率高、可转染分裂期和非分裂期细胞；可整合入宿主细胞基因组内、能携带较大且多个外源基因、感染细胞后能长期稳定表达目的基因。因此选用慢病毒载体作为HLA-G基因的转染工具，以确保HLA-G基因高效、稳定、长期表达在目的细胞或器官中。

本实验所构建载体携带绿色荧光蛋白基因，感染细胞后可以表达绿色的荧光，便于在荧光显微镜下直接观察。本实验成功构建HLA-G基因慢病毒表达载体，并包装出具有高效感染率的慢病毒颗粒，为下一步将HLA-G基因稳定转染肾实质细胞奠定了坚实的基础。

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Construction of lentiviral vector carrying HLA-G gene and packing of the lentiviruses

Liao Guiyi，Zhong Jinbiao，Zhao Fei，et al
（Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

The human leucocyte antigen-G（HLA-G）gene was synthesized.According to gene sequencing，the lentiviral vector carrying HLA-G was constructed successfully on the basis of cloning plasmid pLV-EF1a-EGFP-N. The constructed lentiviral vectorwas transferred into 293T package cellwith pGag/Pol，pRev and pVSV-G and the lentiviruseswith high infection efficiencywere produced.The virus titerwas1×109TU/ml.Construction of lentiviral vector carrying HLA-G gene and packing of the lentiviruses laid thematerial foundations for the study of HLA-G gene in inducing immune tolerance of transplanted kidney.

HLA-G；lentivirus；gene engineering；immune tolerance

R 392.4

A

1000-1492（2016）03-0457-04

时间：2016/1/28 14：23：11 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.068.html

2015-12-08接收

安徽高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2014A123）

安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，合肥 230022

廖贵益，男，副教授，副主任医师，责任作者，E-mail：liaoguiyi2@sina.com