Stathm in在胰腺癌中的表达及意义

黄 敏，余 跃，张 旭，丁 飞，高 萌，许 朝，胡 闻

Stathm in在胰腺癌中的表达及意义

黄 敏1，2，余 跃1，张 旭2，丁 飞1，高 萌1，许 朝1，胡 闻3

目的探讨Stathmin在胰腺癌中的表达水平以及与临床、病理特征方面的关系。方法通过免疫组化法和原位杂交技术分别检测40例胰腺癌癌组织、27例胰腺癌旁正常组织中Stathmin及其mRNA的表达情况。结果Stathmin在胰腺癌癌组织的阳性率显著高于胰腺癌旁正常组织（77.5%vs7.4%），差异有统计学意义（P＜0.05）；Stathmin mRNA的表达阳性率也明显高于癌旁正常组织（80.0%vs 7.4%），差异有统计学意义（P＜0.05）。不同分化程度、有无淋巴结转移、有无远处转移以及TNM分期等方面胰腺癌组织之间的Stathmin表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论Stathmin及其mRNA在胰腺癌组织的高水平表达，与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期密切相关，提示Stathmin可能参与了胰腺癌发生、发展，Stathmin对胰腺癌的早期诊断及预后判断有重要意义。

胰腺癌；Stathmin；免疫组化；原位杂交

胰腺癌为常见消化道恶性肿瘤之一，5年生存率仅6%［1］。Stathmin化学本质是一种微管不稳定磷蛋白，在细胞周期不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用来影响细胞内微管系统动力状态，从而对细胞周期的进程变化发挥了至关重要作用。研究［2］显示Stathmin在多种人类恶性肿瘤中呈高水平表达，但在胰腺癌的过表达现象国内外研究却鲜有报道。该研究通过采用免疫组化、原位杂交方法分析Stathmin及mRNA在胰腺癌组织高水平表达情况，探讨其与临床、病理特征方面的关系，旨在为胰腺癌的早期诊断、预后判断提供一种新的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料与组织标本选取安徽医科大学附属省立医院2009年4月～2014年5月经手术切除治疗，临床资料完整的胰腺癌患者40例，均经病理组织学检查证实。其中男23例，女17例；年龄41～73（60.52±7.54）岁；肿瘤Ø2～8 cm；高、中分化组18例，低分化组22例；无淋巴结转移组19例，有淋巴结转移组21例；无远处转移组21例，有远处转移组19例；TNM分期：Ⅰ期0，Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期21例。术前所有患者均没有接受放疗、化疗等相关治疗。选取了同期手术的胰腺癌旁正常组织27例作对照。

1.2 主要试剂及探针鼠抗人的Stathmin抗体（英国Abcam公司）；浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Stathmin mRNA的原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）；Stathmin基因的寡核苷酸探针序列为：5′-TCTTTCACCTGGATATCAGAAGA AGCCAT-3′。

1.3 方法

1.3.1应用原位杂交法检测 石蜡切片先脱蜡，再脱水；然后用3%H2O2来灭活内源性的过氧化物酶，在室温下处理30 min之后，再用蒸馏水冲洗；用新鲜配制的胃蛋白酶暴露mRNA的核酸片段，37℃消化10～30 min，随后用PBS冲洗；湿杂交盒准备：干杂交盒在底部添加20%甘油约20 ml来保持湿度；预杂交：先滴加些预杂交液，20μl/片，再放置于42℃的恒温箱内连续孵育4 h；杂交：先甩去了玻片上的多余液体，再滴加些杂交液，20μl/片，随后将原位杂交的专用盖玻片上保护膜揭开，随即盖在切片上面，再放置于42℃的恒温箱内连续孵育14 h；杂交之后洗涤：先揭开了盖玻片，再把上述玻片用30～37℃间水温的2×SSC冲洗2次，每次5 min，之后0.5×SSC冲洗1次，每次15 min，再后0.2× SSC冲洗1次，每次15 min；之后滴加上封闭液，予20μl/片，随后放置于37℃恒温箱中30 min；滴加以生物素化鼠抗地高辛：放置于37℃恒温箱内60 min，PBS冲洗；滴加了SABC：放置于37℃恒温箱内20 min，PBS冲洗；滴加了生物素化过氧化物酶：放置于37℃恒温箱内20 min，PBS冲洗；经过DAB显色、之后复染、随后脱水，再后透明，最后封片。

1.3.2应用免疫组化法染色 先脱蜡、之后水化其组织切片，再抗原修复，3%H2O2去离子水孵育，来阻断内源性的过氧化物酶，之后加Stathmin一抗（1∶100）放置在37℃恒温箱内持续孵育2 h，再用PBS冲洗，再滴加通用型的IgG抗体-HRP多聚体，放置于37℃恒温箱内孵育15 min，PBS冲洗。DAB显色、复染、脱水、透明、封片。阴性对照试验：使用PBS替代一抗。其余同上所述的操作步骤。

1.3.3结果判定标准 Stathmin mRNA以及Smthmin蛋白的阳性表达都位于细胞的胞质，其着色呈棕黄色，在高倍显微镜下观察时随机地选取5个视野（观察细胞数不少于200个/每个视野），按照细胞的着色深浅程度、阳性细胞所占百分率两方面结合来进行结果判定［3］。①按照细胞着色深浅的程度评分：0分，细胞无显色；1分，呈淡黄色；2分，呈棕黄色；3分，呈棕褐色。②按阳性细胞数所占百分率，＜5%视为0分，5%～25%视为1分，26%～50%视为2分，51%～75%视为3分，＞75%视为4分。取①②两项的评分乘积值作为总积分，总积分0分判为阴性（-），1～4分判为弱阳性（+），5～8分判为阳性（），9～12分判为强阳性（）。

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行分析。采用了四格表资料χ2检验进行两样本率比较。

2 结果

2.1 胰腺癌StathminmRNA表达Stathmin mRNA原位杂交表达阳性的显色，位于胞质，显示棕黄色颗粒（图1）。在胰腺癌癌组织、癌旁正常组织呈不同水平表达，阳性表达率分别为80.0%、7.4%，差异有统计学意义（χ2=33.985，P＜0.05）。

2.2 胰腺癌的Stathmin蛋白表达Stathmin蛋白阳性表达，位于胞质，显示棕黄色颗粒（图2）。在胰腺癌癌组织、癌旁正常组织呈不同水平表达，阳性表达率分别为77.5%、7.4%。差异有统计学意义（χ2=31.685，P＜0.05）。

2.3 Stathmin蛋白的表达与胰腺癌临床病理特征的关系对免疫组织化学检测结果进一步分析显示Stathmin蛋白的表达水平与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期存在密切相关性，即分化程度越低、有淋巴结转移、有远处转移，TNM分期越晚者Stathmin蛋白表达的阳性率越高，差异有统计学意义。其中胰腺癌低分化组的Stathmin蛋白阳性表达率95.5%，显著高于高、中分化组55.6%（P＜0.05）；有淋巴结转移组阳性率为95.2%，显著高于无淋巴结转移组57.9%（P＜0.05）；有远处转移组阳性率94.7%，显著高于无远处转移组61.9%（P＜0.05）；临床分期Ⅲ+Ⅳ期组阳性率为95.2%，显著高于Ⅰ+Ⅱ期组57.9%（P＜0.05）。但是Stathmin蛋白胰腺癌的表达，与年龄、性别及病理类型均无关，差异无统计学意义。见表1。

3 讨论

众多研究报道Stathmin在多种恶性肿瘤中如口腔鳞癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等表达增高。研究［4］显示人类乳腺癌中含有突变型的p53基因细胞系的Stathmin增强表达。发现其中由于野生型p53的基因突变或缺失，从而使野生型p53的基因介导Stathmin的蛋白表达负性调节作用明显减弱，这很可能是多种恶性肿瘤Stathmin高水平表达方式的主要机制之一。研究［5］通过观察在肝癌细胞中表达Stathmin，发现了其中p27通过抑制其Stathmin阻止与微管分离作用，干扰了细胞间期的微管功能，若上调p27肝癌细胞中表达，可能抑制了Stathmin蛋白的促肝癌细胞的分裂、增殖功能，从而降低分裂、增殖能力。本研究显示Stathmin mRNA和蛋白在胰腺癌的组织中均呈现高水平表达，与胰腺癌旁正常组织表达的差异有统计学上意义。提示Stathmin可能与胰腺癌发生相关连，这与国外文献报道Stathmin在其他多种恶性肿瘤的生物学行为上是一致的。Jiang etal［6］发现Stathmin过表达能阻止转化生长因子β诱导早期基因1介导的肿瘤细胞生长抑制，靶向Stathmin的小干扰RNA能抑制胰腺癌细胞生长。

本研究还观察到低分化组胰腺癌组织阳性表达率明显高于高、中分化组，差异有统计学意义。Stathmin呈弥漫性分布，且肿瘤细胞分化程度越低，则Stathmin表达越增强。因此，表明了Stathmin表达与其细胞的分化程度相关。Stathmin的表达很可能是胰腺癌的分化程度标志之一。

本研究进一步观察到淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，远处转移组显著高于无远处转移组，临床分期较晚的Ⅲ+Ⅳ期组显著高于较早的Ⅰ+Ⅱ期组。表明Stathmin异常高水平表达，与胰腺癌生物学行为间有密切相关。王峰等［7］研究发现食管鳞癌的细胞系的Stathmin mRNA及其蛋白均出现高表达水平。其与食管鳞癌分化的程度、淋巴结的转移、肿瘤的浸润深度以及TNM分期等方面显著相关，食管鳞癌的组织中Stathmin mRNA及蛋白阳性表达率较癌旁组织以及正常的食管黏膜组织相比明显增高。Jeon et al［8］也发现Stathmin蛋白过表达现象可能与胃癌分化的程度、淋巴结的转移、癌瘤浸润深度等方面以及TNM分期有关；胃癌Stathmin的蛋白阳性表达患者其无复发的中位生存期明显小于Stathmin的蛋白阴性表达的患者。使用siRNA技术把SNV16胃癌的细胞系Stathmin敲除后，发现其细胞增殖、移行以及浸润等方面恶性的生物学行为上受到了明显抑制。

综上所述，Stathmin及其mRNA在胰腺癌组织中表达明显增高。Stathmin高水平表达与胰腺癌患者的年龄、性别及病理类型方面无关，而与其分化的程度、淋巴结的转移、远处转移和临床分期等生物学行为密切相关。

［1］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A，et al.Cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2013，63（1）：11-30.

［2］ Belletti，Baldassarre，Stathmin：a protein with many tasks.New biomarker and potential target in cancer［J］.Expert Opin Ther Targets，2011，15（11）：1250-65.

［3］ Gfroerer S，Metzger R，Fiegel H，etal.Differential changes in intrinsic innervation and interstitial cellsof Cajal in small bowel atresia in newborns［J］.World JGastroenterol，2010，16（45）：5716 -21.

［4］ Afli E，Bash Bnhula J，Yang JM，etal.Effectof stathmin on the sensitivity to antimicrotubule drugs in human breast cancer［J］. Cancer Res，2002，62（23）：6864-9.

［5］ Wang X Q，Lui E L，CaiQ，etal.p27Kip1 promotesmigration of metastatic hepatocellular carcinoma cells［J］.Tumour Biol，2008，29（4）：217-23.

［6］ Jiang L，Chen Y，Chan C Y，etal.Down-regulation of stathmin is required for TGF-beta inducible early gene 1-induced growth inhibition of pancreatic cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，274（1）：101-8.

［7］ 王 峰，王留兴，何伟，等.Stathmin基因在食管鳞癌中的表达及生物学意义［J］.南方医科大学学报，2010，30（7）：1552-7.

［8］ Jeon T Y，Han M E，Lee YW，etal.Overexpression of stathmin1 in the diffuse type ofgastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells［J］.Br JCancer，2010，102（4）：710-8.

Clinical significance of expression of stathm in in pancreatic cancer

Huang Min1，2，Yu Yue1，Zhang Xu2，et al
（1Division of Gastroenterology，Affiliated Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001；2Division of Gastroenterology，The Third Hospital of Bengbu City，Bengbu 233000；3Division of Pathology，Affiliated Provincial Hospital，AnhuiMedical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the relationship between the clinicopathological features and Stathmin expression in pancreatic cancer.MethodsExpressions of Stathmin and Stathmin mRNA were detected in 40 pancreatic cancer samples，27 adjacent normal samples of pancreatic cancer by immunohistochemistry and in situ hybridization，respectively.ResultsStathmin positive rate in pancreatic cancer sampleswas significantly higher than that of adjacent normal samples of pancreatic cancer（77.5%vs 7.4%，P＜0.05）；the positive rate of Stathmin mRNA expression was also higher than thatof adjacentnormal samples of pancreatic cancer（80.0%vs7.4%，P＜0.05）. Stathmin expression levelswere signifecantly correlated to the differentiation degree，lymph nodemetastasis，distantmetastasis and TNM staging for pancreatic cancer（P＜0.05）.ConclusionHigher expression of Stathmin and mRNA in pancreatic cancerwere closely related to the differentiation degree for pancreatic cancer，lymph node metastasis，distantmetastasis and TNM staging，suggesting Stathmin may be involved in oncogenesis of pancreatic cancer.Stathmin may play important roles in early diagnosis and prognosis of pancreatic cancer.

pancreatic cancer；Stathmin；immunohistochemistry；in situ hybridization

R 735.9

A

1000-1492（2016）03-0446-04

时间：2016/1/28 14：23：11 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.062.html

2016-01-07接收

安徽省自然科学基金（编号：1508085SQH224）

1安徽医科大学附属省立医院消化内科，合肥 230001

2安徽省蚌埠市第三人民医院消化内科，蚌埠 233000

3安徽医科大学附属省立医院病理科，合肥 230001

黄 敏，硕士研究生；

余 跃，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：yuyuemd@hotmail.com