碳源及植物生长调节剂对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响

程孝中， 许 勇， 葛永斌， 蒲顺昌， 燕傲蕾， 张 宇， 徐 娟

(1.亳州师范高等专科学校,安徽亳州 236800;2.安徽省医学科学研究院,安徽合肥 230061)



碳源及植物生长调节剂对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响

程孝中1， 许 勇2*， 葛永斌1， 蒲顺昌1， 燕傲蕾1， 张 宇1， 徐 娟1

(1.亳州师范高等专科学校,安徽亳州 236800;2.安徽省医学科学研究院,安徽合肥 230061)

摘要[目的]研究不同碳源和植物生长调节剂对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响。[方法]以亳芍根茎为外植体，改变培养基中碳源(蔗糖、果糖、葡糖糖、麦芽糖、可溶性淀粉)和植物生长调节剂种类(6-BA、NAA、2,4-D)，考察亳芍愈伤组织增长量和芍药苷积累量。[结果]碳源中，对亳芍愈伤组织的增长量以蔗糖最高，葡糖糖最有利于芍药苷积累；组合使用植物生长调节剂6-BA、NAA和2,4-D比单独使用6-BA更有利于愈伤组织生长和芍药苷积累，但高浓度的2,4-D抑制愈伤组织生长和芍药苷积累。[结论]确定了亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的最佳碳源和植物生长调节剂组合，为葡萄糖30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L。

关键词亳芍；愈伤组织；碳源；植物生长调节剂；芍药苷

Effects of Carbon Sources and Plant Growth Regulators on Callus Growth and Paeoniflorin Accumulation ofPaeonialactiflora

CHENG Xiao-zhong1,XU Yong2*,GE Yong-bin1et al (1. Bozhou Teachers College, Bozhou, Anhui 236800; 2. Anhui Academy of Medical Sciences, Hefei, Anhui 230061)

Abstract[Objective] To study the influence of different carbon sources and plant growth regulators on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora.[Method] The callus ofPaeonialactifloraroot was used as materials.The callus increment and paeoniflorin accumulation was studied by manipulation of different carbon sources(sucrose,glucose,fructose,maltose,soluble starch) and plant growth regulators(6-BA,NAA,2,4-D).[Result] Sucrose was best for the increment of callus,but glucose was best for the paeoniflorin accumulation.Compared with 6-BA,combined utilization of 6-BA,NAA and 2,4-D was more conductive to increase the callus growth and paeoniflorin accumulation.Otherwise,high concentration of 2,4-D inhibited the callus growth and paeoniflorin accumulation.[Conclusion] The optimum carbon sources and plant growth regulators for callus growth and paeoniflorin accumulation was glucose 30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L.

Key wordsPaeonialactiflora; Callus; Carbon sources; Plant growth regulators; Paeoniflorin

亳芍(Paeonialactiflora)即白芍，因产于亳州而得名，为毛茛科多年生草本植物，性微寒，味微苦而酸，有镇痛、镇静、解痉的作用，可以用来治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肝炎、痛经、发热等疾病[1]。近年来人们对芍药的药用价值研究发现，其中主要成分芍药苷(paeoniflorin)能够通过抑制肾脏中的ICAM-1、IL-1、TNF-α等细胞因子，起到抗炎症、抗氧化作用[2]。另外，芍药苷通过调节腺苷A1受体减少痛疼，抑制前列腺素E2、白三烯B4来减少炎症反应，促进淋巴细胞增殖和分化来实施免疫保护[1]；在抑制血管发生[3]、抗过敏等方面均发挥了重要的作用[4]。但亳芍生长周期较长(3~4年)，加上原产地种植率下降，地道的亳芍产量急剧下降。组织培养技术既可以缩短生长周期，对药材成分的含量又可以进行有效的质量控制。由于碳源和植物生长调节剂是影响植物组织培养的2个重要因素，因此，笔者进行了碳源和植物生长调节剂对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响试验，筛选出亳芍愈伤组织生长和芍药苷含量较高的碳源以及植物生长调节剂，以期为进一步进行组织培养生产芍药苷奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料亳芍采自亳州师范高等专科学校药园(3年生)，取植株根、茎等部位为外植体。

1.2仪器与试剂SD25-12DTDN 超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；DIIG-9141A 电热鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；GI54DWS 高压蒸汽灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)；SW-CJ-2FD 净化工作台(AIRTECH)；ZXSD-A1160 培养箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)；E2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)。芍药苷标准品、植物激素均为阿拉丁产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1愈伤组织培养。取亳芍根、茎等外植体，洗洁精漂洗1遍，流动水洗至无泡沫。在超净工作台上，用75%酒精消毒1 min，再用无菌水洗涤3遍，0.1%升汞消毒6 min，再用无菌水洗涤3遍，无菌滤纸吸干残留水分，剪切好的外植体接种于培养基上培养。碳源筛选采用1/2MS 培养基，添加不同碳源30 g/L(表1)、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L 、2,4-D 0.2 mg/L和琼脂8 g/L，植物生长调节剂筛选采用1/2MS 培养基，添加不同植物生长调节剂(表2~3)、蔗糖 30 g/L和琼脂8 g/L。培养条件为温度 25 ℃、湿度 60%、光照强度 2 000 lx、光周期 12 h/d。培养30 d后，干燥至恒重，粉碎过60目筛并计算愈伤组织增长量,愈伤组织增长量=收获量/瓶数-接种量/瓶数。

1.3.2芍药苷提取。称取愈伤组织干粉1 g置50 mL容量瓶中，加入50%乙醇超声提取30 min，冷却后过0.45 μm滤膜，所得滤液冷冻干燥。

1.3.3芍药苷含量测定。芍药苷含量测定采用高效液相色谱法，色谱柱为C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈和0.1%磷酸(14∶86)；流速1 mL/min；检测波长230 nm。以芍药苷标准品为参考，其回归方程为A=41 372C+24 462(R2=0.997 5)。

2结果与分析

2.1碳源对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响碳源是培养基中最基本的营养成分，提供了植物代谢中所需要的物质和能量，因而对愈伤组织的生长有显著影响。利用5种不同碳源进行试验，结果表明(表1)，对亳芍愈伤组织增长量以蔗糖最高，可溶性淀粉的增长量最低，仅为蔗糖增长量的56%，果糖、麦芽糖和葡糖糖对亳芍愈伤组织增长量的影响无显著差异；而对芍药苷积累的影响中，以葡糖糖作为碳源时，愈伤组织的芍药苷积累量最高，可溶性淀粉的芍药苷积累最低，为葡糖糖的54%。

表1不同碳源对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响

Table1EffectsofdifferentcarbonsourcesoncallusgrowthandpaeoniflorinaccumulationofPaeonia lactiflora

碳源Carbonsources增长量Incrementg芍药苷量Quantityofpaeoniflorinmg/g蔗糖Sucrose0.46±0.05a0.03300±0.00387b果糖Fructose0.37±0.04b0.02980±0.00293b葡糖糖Glucose0.40±0.03ab0.04217±0.00488a麦芽糖Maltose0.33±0.04b0.03083±0.00397b可溶性淀粉Solublestarch0.26±0.03c0.02283±0.00331c

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

2.26-BA和NAA对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响由表2可见，当0.5 mg/L 6-BA与NAA联合使用时，亳芍愈伤组织增长量和芍药苷积累量均高于单独使用6-BA，其中以0.5 mg/L 6-BA与0.2 mg/L NAA联合使用效果最佳，愈伤组织增长量和芍药苷积累均达最大值，但随着NAA浓度增大，愈伤组织增长量和芍药苷积累量出现下降趋势。

表26-BA和NAA对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响

Table 2Effects of 6-BA and NAA on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora

植物生长调节剂Plantgrowthregulators∥mg/L增长量Increment∥g芍药苷量Quantityofpaeoniflorin∥mg/g6-BA0.50.32±0.04b0.03417±0.00556b6-BA0.5+NAA0.10.38±0.06ab0.03817±0.00354ab6-BA0.5+NAA0.20.45±0.66a0.04517±0.00542a6-BA0.5+NAA0.30.35±0.04b0.03583±0.00691b

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

2.36-BA、NAA和2,4-D相互作用对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响 在6-BA和NAA基础上添加2,4-D后，低浓度和高浓度的2,4-D均能影响愈伤组织增长量和芍药苷积累量，只有适当浓度的2,4-D(0.2 mg/L)可以增加愈伤组织的增长和芍药苷积累(表3)。但6-BA、NAA和2,4-D联合使用比单独使用6-BA效果好(表2~3)。

表3 6-BA、NAA和2,4-D相互作用对亳芍愈伤组织生长和芍药苷积累的影响

Table 3Effects of interaction of 2,4-D, NAA and 6-BA on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora

植物生长调节剂Plantgrowthregulators∥mg/L增长量Increment∥g芍药苷量Quantityofpaeoniflorin∥mg/g6-BA0.5+NAA0.20.45±0.07b0.04517±0.00542b6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.10.41±0.03b0.04483±0.00605b6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.20.53±0.04a0.05467±0.00472a6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.30.40±0.03b0.04117±0.00436b

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

3结论与讨论

该试验结果表明,以30 g/L蔗糖作为碳源时亳芍愈伤组织增长量最高，而以30 g/L葡糖糖作为碳源时芍药苷积累最高，试验结果与凌庆枝等[5]的研究结论一致。植物细胞在培养基中不能自养，需要外界提供碳源进行新陈代谢，而碳源的来源有多种，在组织培养中，以蔗糖、果糖、葡糖糖、麦芽糖等应用较多。不同植物组织培养的最适碳源有差异，但大部分植物是以蔗糖作为碳源，如水母雪莲[6]、甜叶菊[7]、杜仲[8]等。这是因为蔗糖可以提供细胞生长所需要的渗透压，并作为次生代谢物积累的物质来源；而芍药苷的积累以葡糖糖为最佳，这可能与葡萄糖可以直接被细胞吸收，并直接进入糖酵解途径有关。

该试验发现，植物生长调节剂对亳芍愈伤组织增长量以及芍药苷累积量均有较大影响。单独使用6-BA时，亳芍愈伤组织增长量及芍药苷积累均不及组合使用植物生长调节剂，6-BA 与NAA 组合使用时，当NAA浓度达0.2 mg/L时，能够促进愈伤组织增长量和芍药苷积累，低浓度与高浓度的NAA均未能显著促进愈伤组织增长和芍药苷积累，且愈伤组织增长与芍药苷增长相关。这种规律同样出现在6-BA、NAA、2,4-D 3种生长调节剂组合使用时。

植物组织培养中，生长调节剂既可以促进细胞分裂，也可以影响细胞分化，这主要与生长调节剂种类和浓度有关[9-10]，6-BA主要促进愈伤组织生长，NAA可以促进生根，而2，4-D既可以促进愈伤组织生长，也可以促进生根，将3种生长调节剂组合使用时，可以控制亳芍器官发生模式[11]，但不同植物的组织培养使用的组合是不同的。该试验筛选出的组合能够促进亳芍愈伤组织增长的同时，也能显著地促进芍药苷积累。但各种激素相互作用的机制尚不清楚，有待进一步研究。

参考文献

[1] HE D Y，DAI S M.Anti-inflammatory and immunomodulatory effects ofPaeonialactifloraPall.a traditional chinese herbal medicine[J].Frontiers in pharmacology,2011,2(2):10.

[2] WU Y G,REN K J,LIANG C,et al.Renoprotective effect of total glucosides of paeony (TGP) and its mechanism in experimental diabetes[J].J Pharmacol Sci,2009,109:78-87 .

[3] DENG H,YAN C,XIAO T,et al.Total glucosides ofPaeonialactifloraPall. inhibit vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis[J].J Ethnopharmacol,2010,127(3):781-785.

[4] LEE B,SHIN Y W,BAE E A,et al.Antiallergic effect of the root ofPaeonialactifloraand its constituents paeoniflorin and paeonol[J].Arch Pharm Res, 2008,31(4):445-450.

[5] 凌庆枝，董丽辉，章聪敏，等.中药白芍愈伤组织的培养及其中芍药苷的测定[J].安徽农业科学，2013,41(11)：4705-4708.

[6] 邢建民，赵德修，李茂寅.碳源和氮源对水母雪莲悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响[J].生物工程学报，1999,15(2)：230-234.

[7] 沈秀丽，徐仲.甜叶菊组织培养条件的研究Ⅱ.不同基本培养基、不同碳源对愈伤组织形成及芽诱导的影响[J].中国糖料，1997(4):9-10.

[8] 李琰，王冬梅，姜在民，等.培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响[J].西北植物学报，2004,24(10)：1912-1916.

[9] 杜亚填，陈建华，许建宇，等.植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响[J].天然产物研究与开发，2006，18(4):569-576.

[10] 杨帆,张万博,朗贤波,等.植物生长调节剂对树莓组培苗增殖生长的影响[J].延边大学农学学报,2014(1):12-15.

[11] 倪德祥.植物生长调节剂在组织培养中的调控作用[J].自然杂志，1987,10(1)：35-39.

收稿日期2015-12-28

作者简介程孝中(1983- )，男，安徽安庆人，讲师，在读博士，从事中草药组织培养和内生菌研究。*通讯作者，助理研究员，硕士，从事分子生物学及生物化学方面研究。

基金项目安徽省高校自然科学基金项目(KJ2014A167)；亳州师范高等专科学校校级科研项目(BZSZKYXM201304)。

中图分类号Q 567.23+9;Q 813.1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-136-02