毛蒟水提物对CCl4所致小鼠肝损伤的保护作用

吴　芹，金美林，徐亚沙，沈　刚，陶　娜，陆远富，徐云燕，刘　杰，石京山

(1.遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

毛蒟水提物对CCl4所致小鼠肝损伤的保护作用

吴芹1，金美林2，徐亚沙1，沈刚1，陶娜1，陆远富1，徐云燕1，刘杰1，石京山1

(1.遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099；2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 研究毛蒟水提物对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法 雄性昆明种小鼠随机分为空白对照组，模型组，毛蒟水提物低、高剂量组，采用CCl4建立急性肝损伤模型。观察毛蒟水提物对模型组小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性，小鼠肝脏指数和肝组织中Egr-1、TNF-α mRNA表达的影响，以及肝组织的病理学改变。结果 毛蒟水提物给药组可明显降低CCl4所致肝损伤小鼠血清中AST、ALT的活性(P<0.01)，降低肝脏组织中Egr-1和TNF-α mRNA的表达水平(P<0.05)；可明显改善CCl4所致肝脏病理细胞损伤，炎症细胞明显减少，且高剂量组更为显著。结论 毛蒟水提物对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，其机制可能与抑制Egr-1和TNF-α等炎症通路因子的表达有关。

[关键词]毛蒟水提物；急性肝损伤；四氯化碳；Egr-1；TNF-α

黔产毛蒟[Piperpuberulum(Benth)]为胡椒科(Piperaceae)胡椒属植物，别名小墙风、小毛蒌、石楠藤等，药用其干燥全株。主要分布于我国的四川、云南、贵州、广西、广东等地[1]。具有行气止痛，祛风活血之功效，可治疗风湿性痹痛、风寒头痛、胃脘痛等症[2]。有研究报道表明，毛蒟具有抗血小板聚集、抗炎、抗肿瘤及镇痛等药理作用[3-5]。在贵州民间应用毛蒟干燥全株煎剂，对治疗急、慢性肝损伤疗效较好，但其机制尚不明确。本实验采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤动物模型，观察毛蒟水提物对肝损伤的保护作用，并初步分析其作用机制，为进一步开发利用黔产毛蒟提供药理学实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1药品与试剂毛蒟药材采自贵州省黔东南州锦屏县，经贵州省遵义医学院附属医院药剂科杨建文副教授鉴定为胡椒科胡椒属植物毛蒟的全株。RNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)，引物设计(大连宝生物工程有限公司)；High Capacity Reverse Transcriptase Kit(Applied Biosystems, USA)，SYBR® PCR Master Mix (美国ABI公司)；谷丙转氨酶(GPT/ALT)测试盒，谷草转氨酶(GOT/AST)测试盒(南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(重庆市九龙化学试剂厂)，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2毛蒟提取物的制备取干燥的毛蒟全株干品，粉碎成粉末，过10目筛，称取100.0 g置于5 000 mL圆底烧瓶中，加入3 000 mL(30倍量)蒸馏水，浸泡2 h，每次煎煮2 h，共3次。真空抽滤，合并水煎滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥机干燥，得17.62 g干燥物。将其总提物经D-101大孔树脂分离，减压回收得到水提浸膏。

1.1.3动物雄性昆明种小鼠40只，SPF级，体重(20±2)g，从重庆第三军医大学实验动物中心购买，许可证号：SCXK(军)2012-0011。

1.1.4仪器通用酶标仪(美国Bio-Rad公司)，5417R型冷冻离心机(德国Eppendorf)，BS100S型电子分析天平(北京德赛公司)，R-200 旋转蒸发仪(瑞士BUCHI 公司)，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，RE-2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，X-15R型冷冻离心机(美国贝克曼公司)，Icycler IQ型实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组、制模及给药将40只健康雄性昆明种小鼠随机分为4组：空白对照组、模型组、毛蒟水提物低剂量组(0.5 g/kg)、毛蒟水提物高剂量组(1.0 g/kg)，每组10只。毛蒟各剂量组分别按0.1 mL/10 g灌胃给药，空白对照组和模型组给予等体积生理盐水，连续灌胃7 d，于末次给药1 h后，除空白对照组外，模型组和毛蒟各给药组按0.1 mL/10 g剂量腹腔注射0.2% CCl4溶液建立急性肝损伤模型，禁食不禁水，制模24 h后称量小鼠体重，收集血液及取肝脏进行相关指标检测。

1.2.2小鼠肝脏指数的计算剖取肝脏，称其重量，按肝脏指数=肝脏重量(g)/体重(g)×100%，计算小鼠肝脏指数。

1.2.3血清中AST和ALT活性检测采用眼眶取血，小鼠全血在室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，制备血清，按照试剂盒说明书的操作方法，于全自动生化仪上测定ALT和AST活性。

1.2.4肝脏组织形态学观察切取相同部位肝组织置10%甲醛溶液中固定48 h，进行石腊包埋，切片，常规HE染色。光镜下观察肝脏组织形态学变化。

1.2.5Real-Time RT PCR检测相关基因的表达取肝组织50~100 mg置于1 mL Trizol中，提取肝脏总RNA，测定其浓度及纯度，然后将其逆转录为cDNA并稀释，进行聚合酶链式反应。以β肌动蛋白(β-actin)为参照，用相对量法计算早期生长反应基因-1(Egr-1)、肿瘤坏死因子α (TNF-α) mRNA的表达水平。以Ct值为统计参数，采用目的基因及β-actin基因相对含量的比值作为评价标准，对实验中目的基因进行相对定量，引物序列(见表1)。

表1实时荧光定量PCR引物序列

基因基因编号 上游引物 下游引物β-actinV01217TGACCGAGCGTGGCTACAGGGGCAACATAGCACAGCTTCTEgr-1M20157AGGTTCCCATGACCCTGACTGGTACGTTCTCCAGACCCTGTNF-αNM_013693.2GGTTCTCTTCAAGGGACAAGGTGGAAGACTCCTCCCAGGTAT

2结果

2.1毛蒟水提物对CCL4所致急性肝损伤小鼠的体重和肝脏指数的影响各组间小鼠体重无明显差别。与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏指数显著升高(P<0.05)，结果提示，小鼠肝脏受损；与模型组比较，毛蒟水提物各剂量组的肝脏指数均显著降低(P<0.05，见表2)。

组别给药剂量(g/kg)体重(g)肝重指数(%)空白对照组—26.7±2.505.0±0.21模型组—28.6±0.205.6±0.20#毛蒟低剂量组0.528.1±2.004.3±0.18*毛蒟高剂量组1.026.8±2.405.2±0.50*

#：P<0.05，与空白对照组比较； *：P<0.05，与模型组比较。

2.2毛蒟水提物对CCL4所致急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响与空白对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST活性均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，毛蒟水提物低剂量组和高剂量组均明显降低CCl4所致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05)，且高剂量给药组更为显著(见表3)。

组别给药剂量(g/kg)AST(U/L)ALT(U/L)空白对照组—54.51±14.43206.40±22.64模型组—225.68±12.36#412.50±73.60#毛蒟低剂量组0.5148.57±32.24*247.41±77.46*毛蒟高剂量组1.0109.75±8.40*180.41±6.60*

#：P<0.05，与空白对照组比较；*：P<0.05，与模型组比较。

2.3毛蒟水提物对CCL4所致急性肝损伤小鼠肝脏组织病理学的影响小鼠肝组织HE染色，光镜下观察显示，空白对照组小鼠的肝脏结构正常，肝索排列规则，肝细胞形态正常。模型组中央静脉向四周呈片状病灶性坏死，肝小叶中央静脉区有炎症细胞浸润，肝小叶结构被破坏。给药组肝组织病灶性坏死消失，在高剂量组中肝小叶结构基本完整，炎症细胞浸润明显减轻，仅见中央静脉周围细胞轻微水肿(见图1)。

A：空白对照组；B：模型组；C：毛蒟低剂量组；D：毛蒟高剂量组。图1　毛蒟水提物对小鼠肝组织形态学变化的影响(HE，×200)

2.4毛蒟水提物对CCL4所致急性肝损伤小鼠肝组织中Egr-1和TNF-α mRNA表达的影响与空白对照组比较，模型组小鼠肝组织中Egr-1和TNF-αmRNA的表达均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，给药组小鼠肝组织中Egr-1和TNF-α mRNA表达明显降低(P<0.05)，且高剂量组更显著(见图2)。

#：P<0.05，与空白对照组比较；*：P<0.05，与模型组比较。图2　毛蒟水提物对小鼠Egr-1(A)和 TNF-α(B)mRNA表达的影响

3讨论

CCl4肝损伤动物模型是实验性肝损伤的经典模型[6]，当CCl4进入体内后，在肝细胞色素P450激活下生成自由基，CCl4通过氢吸附而攻击内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，导致细胞膜结构和功能的破坏。CCl4还可以抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性，使Ca2+内流增加，引起细胞中毒死亡。胞质内ALT、AST大量释放进入血液，使血液中ALT、AST异常升高[7-9]，故血清中ALT和AST活性可反映肝脏受损伤的程度。本实验CCl4模型组小鼠ALT和AST活性显著升高，同时组织形态学可见肝小叶病灶性坏死，并伴有炎症细胞浸润，肝小叶结构被破坏，说明造模成功。给予毛蒟水提物后，与模型组比较，毛蒟水提物可使小鼠血清中ALT活性明显降低，AST呈下降趋势，形态学见肝小叶结构基本较完整，炎症细胞浸润明显减轻，提示毛蒟水提物对CCl4诱导的肝损伤具有保护作用。

Egr-1是炎症通路的重要因子，文献报道Egr-1能促进脂多糖介导的TNF-α的表达，同时还可以调控众多炎症介质[10-12]如ICAM-1A、MCP-1的表达，促进炎症发生。本实验采用CCl4诱导肝损伤后，模型组Egr-1和TNF-α的基因表达明显上调，毛蒟水提物给药组则可明显下调小鼠Egr-1基因的表达。提示毛蒟水提物对CCl4所致急性肝损伤的保护作用机制可能与其抑制炎症通路因子Egr-1、TNF-α的表达有关。

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[收稿2015-12-15;修回2016-01-10]

(编辑：王静)

Protective effects of aqueous extract ofPiperpuberulumagainst acute hepatic injury induced by CCl4in mice

WuQin1,JinMeilin2,XuYasha1,ShenGang1,TaoNa1,LuYuanfu1,XuYunyan1,LiuJie1,ShiJingshan1

(1.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Pharmacy School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To study the protective effects and mechanisms of aqueous extract of Piper puberulum against carbon tetrachloride (CCl4)-induced acute hepatic injury in mice. Methods The male kunming mice were divided into four groups: normal, model, low dose and high dose of aqueous extract of P. puberulum groups. The acute liver injury in mice was induced by ip injection of CCl4. Sixteen hr after CCl4intoxication, the hepatic indices were calculated. The activities of serum ALT and AST were determined. RT-qPCR was performed to determine the gene expression of Egr-1 and TNF-α. Histopathological changes of liver tissue slices stained by HE staining were observed under light microscope. Results The activities of ALT, AST were significantly decreased by aqueous extract of P. puberulum pretreatment (P<0.01), and the gene expression of Egr-1 and TNF-α in hepatic tissues was also markedly decreased (P<0.05). Histopathological results showed the obvious improvement of liver injury in aqueous extract of P. puberulum pretreatment groups. Conclusion Aqueous extract of P. puberulum has protective effects against CCl4-induced acute hepatic injury in mice, and the mechanisms might be associated with the inhibition of expression of Egr-1 and TNF-α.

[Key words]aqueous extract of Piper puberulum (PPE); acute hepatic injury; carbon tetrachloride (CCl4); early growth response gene-1 (Egr-1); tumor necrosis factor alpha (TNF-α)

[中图法分类号]R285.5；R965.1

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0014-04

[通信作者]刘杰，男，博士，研究员，研究方向：药物代谢与毒理学研究，E-mail:jie@liuonline.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81560682)；贵州省教育厅招标项目(NO：黔科教KY-2012-055)；贵州省中医药管局资助项目(NO：QZYY20)；贵州省科技厅药物代谢动力学平台项目(NO：黔科2008-002)。