脊髓背角大麻素受体2介导CP55940对CCI大鼠的镇痛作用

孙　涛，杨舒蕾，龙景东，曾俊伟,2，陈远寿，田　虹，刘晓红,2

(1.遵义医学院基础医学院 生理学教研室，贵州 遵义　563099；2.贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

脊髓背角大麻素受体2介导CP55940对CCI大鼠的镇痛作用

孙涛1，杨舒蕾1，龙景东1，曾俊伟1,2，陈远寿1，田虹1，刘晓红1,2

(1.遵义医学院基础医学院 生理学教研室，贵州 遵义563099；2.贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察脊髓背角大麻素受体2(CB2R)是否参与大麻素类药物CP55940对慢性坐骨神经缩窄性损伤(CCI)所致神经病理性疼痛的镇痛作用，并初步探讨其机制。方法 成年SD大鼠随机分为4组：对照组、CCI组(鞘内注射DMSO生理盐水)、CP55940+CCI组(鞘内注射0.05 mg/kg CP55940)、AM630+CP55940+CCI组(鞘内注射10-8mol/L AM630，20 min后再给予0.05 mg/kg CP55940)。各组大鼠均于鞘内置管5 d后行CCI术，术后连续14 d鞘内注射给药，每天1次；于CCI术前1 d，术后第1、3、5、7、10、14 天鞘内给药1 h后测定热缩足潜伏期(TWL)。分别于CCI术后第7天和第14天处死大鼠，取术侧L4~L6脊髓背角，采用免疫印迹技术检测脊髓背角CB2R及丝裂原活化蛋白激酶家族中p38(p38 MAPK)表达情况。结果 大鼠CCI术后即形成稳定的热痛敏，TWL明显缩短；鞘内给予非选择性CB受体激动剂CP55940(0.05 mg/kg)可明显延长CCI大鼠TWL(P<0.05)；选择性CB2受体拮抗剂AM630(10-8mol/L)可部分阻断CP55940的镇痛效果(P<0.05)。免疫印迹实验结果显示，CCI术可导致术侧脊髓背角CB2R、p38表达增加(P<0.01)；鞘内给予CP55940可诱导CCI所致的CB2R表达进一步增加(P<0.01)，但明显降低CCI所致的p38表达增加(P<0.01)；预先鞘内注射CB2R拮抗剂AM630可阻断CP55940对CB2R及p38表达的影响(P<0.01)。结论 鞘内给予大麻素类药物CP55940对CCI所致的神经痛具有良好的镇痛效应，CB2R通过可能抑制脊髓背角胶质细胞p38的活性参与了CP55940的镇痛作用。

[关键词]神经病理性疼痛；CB2受体；脊髓背角；大麻素；P38丝裂原活化蛋白激酶

大麻用于镇痛的记载可追溯到数百年前，近年研究逐渐认识到在哺乳动物体内存在内源性大麻素递质系统，中枢和周围神经组织广泛表达的CB1受体(Cannabinoid receptor 1, CB1R)和CB2受体(Cannabinoid receptor 2, CB2R)介导了大麻类物质的作用[1-3]。研究表明，在炎性痛、癌痛或神经病理性疼痛模型，局部或全身应用CB2R激动剂均能显著减轻热痛敏或机械痛敏，这充分说明CB2R参与了大麻素类药物的镇痛作用[4-6]。

脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的激活参与了中枢痛觉过敏的形成，是病理性疼痛发生和持续的关键因素[7-8]。大麻素CB2受体选择性表达于脊髓背角胶质细胞[9]，但脊髓背角CB2R是否介导大麻素镇痛效应及其相关的机制，目前尚不清楚。本实验通过制备慢性坐骨神经缩窄性损伤(chronic constriction injury, CCI)模型，鞘内给予非选择性大麻素受体激动剂CP55940以及特异性CB2受体拮抗剂AM630，观察CB2R是否介导CP55940的镇痛效应，并初步探讨其镇痛机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和器材CP55940、AM630(Sigma，美国)；PE-10导管(美国健康医疗仪器国际公司)；BME-410C型自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；兔抗CB2多克隆抗体(SC-25494)、兔抗p38α多克隆抗体(SC-535)购自美国Santa公司。

1.2方法

1.2.1动物分组体重200～250 g雄性SD大鼠42只由第三军医大学实验动物中心提供(许可证号SCXK[渝]2007-0005)，分为4组：①对照组(假手术组，n=6)；②CCI 组(鞘内注射DMSO生理盐水，n=12)；③ CP55940+CCI组(鞘内注射0.05 mg/kg，n=12)；④AM630+CP55940+CCI组(鞘内先注射10-8mol/L AM630，20 min后再给予0.05 mg/kg CP55940，n=12)。对照组大鼠仅游离右侧坐骨神经，未做其他处理。其余各组大鼠在鞘内置管5 d后行CCI术，术后分别鞘内注射DMSO生理盐水、CP55940和AM630。 CP55940和AM630用DMSO原液溶解，随后用生理盐水稀释至10-8mol/L，对照组鞘内注射DMSO生理盐水。

1.2.2鞘内置管及CCI模型制作参照龙景东等[10]的方法。

1.2.3热痛阈测定参照龙景东等[10]的方法。

1.2.4免疫印迹技术检测脊髓背角CB2R、p38蛋白表达参照田虹等[11]的方法，CCI术后第7、14天处死大鼠(CCI术后第7天每组6只，第14天每组6只)，取CCI大鼠右侧L4～L6的脊髓背角，提取各组大鼠脊髓背角总蛋白，行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转仪将蛋白转移至PVDF膜。PVDF膜用6%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗CB2R多克隆抗体(1∶250)、兔抗p38α多克隆抗体(1∶250)，同时加入小鼠抗β-actin单抗(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。PBS洗膜后，加入抗兔HRP-IgG(1∶2 500)和抗鼠HRP-IgG(1∶2 500)，室温放置1 h。加入化学发光显色试剂，X射线曝光显影，扫描分析软件(Labworks TM Analysis Software，美国)分析数据，蛋白表达水平用每个条带的积分光密度(IOD)值与其相对应β-actin IOD值之比表示(β- actin为内参照)。

2结果

2.1鞘内注射CP55940及AM630对CCI大鼠热痛敏的影响

2.1.1CP55940对CCI大鼠热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的影响与对照组相比，神经痛模型大鼠CCI术后第1天，术侧下肢即对热刺激敏感，TWL明显降低(P<0.05)，到术后14 d，热痛敏仍持续存在。鞘内给予非选择性大麻素受体激动剂CP55940(0.05 mg/kg)可明显升高CCI术所致的TWL降低(P<0.05，见图1)，对神经痛大鼠热痛敏有良好的治疗作用。而鞘内给予DMSO生理盐水对神经痛热痛敏无明显改善。

2.1.2CB2R拮抗剂AM630介导CP55940的镇痛作用AM630为特异性CB2R拮抗剂，预先鞘内给予AM630(10-8mol/L，20 min)可显著抑制CP55940的效应(P<0.05，见图1)，但不能完全阻断其作用。

*：P<0.05，与control相比；#：P<0.05，与CCI相比；+：P<0.05，与CP55940+CCI相比。 图1　鞘内注射CP55940、AM630对CCI大鼠TWL的影响

2.2脊髓背角CB2受体表达变化对照组大鼠脊髓背角CB2R蛋白呈微量表达；与对照组相比，CCI模型大鼠在术后7、14 d CB2R蛋白表达显著增加(P<0.01)，尤其以14 d更为明显；鞘内给予非选择性大麻素受体激动剂CP55940(0.05 mg/kg)可诱导CCI大鼠CB2R表达进一步增高(P<0.01)；而CB2R拮抗剂AM630可明显降低CP55940诱导的CCI大鼠CB2R表达增高(P<0.01，见图2)。

A：CB2R蛋白免疫印迹检测结果；B：CB2R蛋白表达的统计分析；**：P<0.01，与control相比；##：P<0.01，与CCI组相比；++：P<0.01，与CP55940+CCI相比。　　图2　鞘内注射CP55940、AM630对CCI大鼠脊髓背角CB2R表达的影响

2.3脊髓背角p38表达的变化对照组大鼠脊髓背角p38呈微量表达；与对照组相比，CCI大鼠术侧L4~L6节段的脊髓背角p38蛋白在术后第7、14天表达明显增加(P<0.01)；鞘内注射CP55940可明显降低CCI所致的脊髓背角p38表达增加；CP55940降低脊髓背角p38表达的效应可被选择性CB2R拮抗剂AM630阻断(P<0.01，见图3)。

A：p38蛋白免疫印迹检测结果；B：p38蛋白表达的统计分析；**：P<0.01，与control相比；##：P<0.01，与CCI组相比；++：P<0.01，与CP55940+CCI相比。　　图3　鞘内注射CP55940、AM630对CCI大鼠脊髓背角p38表达的影响

3讨论

脊髓背角是机体调制或整合伤害性信息的重要位点。大麻素CB2受体选择性表达于脊髓背角的星形胶质细胞和小胶质细胞[9]，但脊髓背角CB2R是否介导大麻素的镇痛作用及其相关机制，目前尚不清楚。既往研究显示，在各种炎性痛、癌痛和神经痛模型中，局部或全身应用大麻素受体激动剂均可产生明显的镇痛效果[12]。本实验鞘内注射非选择性大麻素受体激动剂CP55940明显延长了CCI大鼠的热缩足反射潜伏期，表明鞘内给予CP55940对慢性坐骨神经结扎所致的神经痛具有良好的镇痛作用。而预先鞘内给予CB2R特异性拮抗剂AM630可明显抑制CP55940的镇痛效应，说明CB2R介导了CP55940的镇痛作用。CB1R、CB2R均表达于脊髓背角，其中CB1R主要表达于背角浅层抑制性中间神经元[13]，CB2R表达于胶质细胞[6]。本课题组以往的研究显示，CB1R拮抗剂AM251可显著抑制、但又不能完全阻断鞘内注射CP55940对CCI大鼠的镇痛效应[10]。由此可见，鞘内注射CP55940对CCI大鼠的镇痛作用可能由脊髓背角CB1R、CB2R共同介导。

本研究免疫印迹实验显示，鞘内给予CP55940可诱导CCI大鼠CB2R表达明显增高，而CB2R拮抗剂AM630可显著降低CP55940诱导的CB2R表达增高。这说明脊髓背角CB2受体表达变化与大麻素类药物镇痛效应密切相关，CB2R表达上调介导了大麻素类药物的镇痛效应；而CB2受体拮抗剂AM630通过抑制CB2R的表达，显著减弱CP55940的镇痛效应。

既往研究表明，丝裂原活化蛋白激酶家族中的p38在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥重要作用，p38的激活可产生大量的炎症因子，包括致炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等， 这些炎症因子继而促进病理性疼痛的产生与维持[13-15]。本研究发现，CCI术可导致神经损伤大鼠术侧脊髓背角p38蛋白表达增加，而鞘内给予CP55940可显著降低CCI所致的p38表达升高，CP55940降低脊髓背角p38表达的效应可被选择性CB2R拮抗剂AM630阻断。这说明CP55940降低CCI大鼠脊髓背角p38表达的效应是由CB2R介导，CP55940的镇痛效应可能与其激活脊髓背角胶质细胞CB2R，继而抑制胶质细胞p38活性密切相关。Landry等[6]的研究也显示L-5脊神经切断所致的脊髓背角MKP-1 和MKP-3(MAPK磷酸酶，为p38MAPK的主要调节因子)表达的降低可被CB2R激动剂JWH015逆转，从而抑制神经损伤大鼠p38MAPK的磷酸化。

Ji等[16]和Tsuda等[17]报道在外周神经损伤引起的病理性疼痛模型中，脊髓背角p38的磷酸化仅局限于小胶质细胞，而在神经元和星形胶质细胞p38不被激活，并且鞘内给予p38抑制剂可减轻神经痛症状。本实验CCI所致的p38表达增加究竟发生于小胶质细胞抑或星形胶质细胞，有待于进一步证实。

本研究结果显示，脊髓背角CB2R在外周神经损伤所致的病理性疼痛中发挥重要作用，CB2受体可能通过抑制脊髓背角胶质细胞的p38活性参与了大麻素类药物的镇痛作用。

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[收稿2015-11-19;修回2015-12-30]

(编辑：王静)

CB2receptors in dorsal spinal horn are involved in analgesia of CP55940 on neuropathic rats with chronic constriction injury

SunTao1,YangShulei1,LongJingdong1,ZengJunwei1,2,ChenYuanshou1,TianHong1,LiuXiaohong1,2

(1.Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；2.Key Lab of Anesthesia and Organ Protection of Guizhou, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective The aim of this study is to examine whether CB2receptor is involved in analgesia of cannabinoids on neuropathic rats with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve. Methods Healthy adult SD rats were randomly divided into control group, CCI group (intrathecal DMSO saline), CP55940+CCI group (CP55940 0.05 mg/kg) and AM630+CP55940+CCI group (AM630 10-8mol/l; CP55940 0.05 mg/kg). SD rats in all groups were intrathecally cathetered at 5 d before CCI operation. All rats were tested for heat hyperalgesia of the plantar surface of the hindpaw 1 day before surgery and 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery. AM630, CP55940 and DMSO saline were intrathecally administered once a day for 14 consecutive days after CCI operation. The values of thermal withdrawal latency (TWL) were examined at 1h after intrathecal injection. The expression of CB2receptors and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) were detected by western blot assay. Results TWL in CCI group were significantly lower than those in sham group on post-operative day (P<0.05). Intrathecal administration of CP55940 (cannabinoid receptor agonist, 0.05 mg/kg) markedly suppressed the decrease in TWL after nerve injury (P<0.05). Intrathecal administration of AM630 (CB2receptor antagonist, 10-8mol/l) markedly suppressed the analgesic effect of CP55940. The immunoblotting assay showed that the expression of CB2receptor and p38 were markedly enhanced in the ipsilateral dorsal horn on days 7 (P<0.01) and 14(P<0.01) after nerve injury. Intrathecal administration of CP55940 further enhanced the expression of CB2receptor after CCI (P<0.01), but markedly suppressed the increased expression of p38 after CCI (P<0.01). Intrathecal administration of AM630 blocked the effect of CP55940 on expression of CB2receptors (P<0.01) and p38 (P<0.01). Conclusion These data indicate that intrathecal administration of cannabinoid receptor agonist CP55940 provides postoperative analgesia effectively on neuropathic rats. CB2receptor activation and the following inhibition of p38 are involved in analgetic effect of CP55940.

[Key words]neuropathic pain；CB2receptor; spinal cord；Cannabinoids；p38 mitogen-activated protein kinases

[中图法分类号]R329.27; R338.1; R977.1

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0006-04

[通信作者]刘晓红，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：痛觉的神经化学机制，E-mail:lxh680718@aliyun.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：31360253)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J[2008]2314)。