生物材料植入感染与表皮葡萄球菌生物膜形成的相关基因调控

邱良婷 叶联华 黄云超

650118昆明医科大学第三附属医院胸心外科

·综述·

生物材料植入感染与表皮葡萄球菌生物膜形成的相关基因调控

邱良婷 叶联华 黄云超

650118昆明医科大学第三附属医院胸心外科

表皮葡萄球菌是寄居于人体皮肤和黏膜表面的共生菌群，现已发现其是引发临床生物材料相关感染的主要条件致病菌，在生物材料植入感染中占有重要地位。医用生物材料表面细菌生物膜的形成是其主要致病因素，细菌生物膜可有效抵御机体的防御反应和抗生素治疗，导致生物材料植入感染难以彻底治愈，使感染呈慢性、持续性和反复性特点，从而在临床上造成了极高的死亡率。就表皮葡萄球菌生物膜的形成、胞间黏附素基因（ica）操纵子和附属基因调节子（agr）基因对表皮葡萄球菌生物膜的调控及其在临床生物材料植入感染中的作用等方面作一综述。

表皮葡萄球菌；生物膜；ica操纵子；agr基因；生物材料

Fund program：NationalNaturalScienceFoundationofChina(81260228,81460278);NaturalScienceFoundation ofYunnanProvince(2013FZ267,2014FA048);YunnanProvincialHigh-levelPersonnelTrainingFund(No.2012HB032, D-201222)

0 引言

近年来，随着人工医疗器械的大量使用，以表皮葡萄球菌为主的院内感染越来越常见。表皮葡萄球菌是一种凝固酶阴性的革兰氏阳性球菌，现已证实其是一种对人类无害的寄居于人体皮肤和黏膜表面的共生菌群，同时也是一种重要的条件致病菌[1-2]，具有产生毒素少和致病力弱的特点。该菌群很难引起健康人群致病，但会使免疫力低下的人群发生感染。表皮葡萄球菌引起感染的最主要方式是能在医用生物材料如留置静脉导管、人工关节、人工心脏瓣膜等表面形成生物膜[3-4]。生物膜的形成为细菌提供了一个保护屏障，增强了细菌抵御抗生素和宿主免疫应答反应的能力[5]。此外，生物膜上的细菌可从原发感染灶上脱落引起感染蔓延，并将毒素释放至血液中，致使表皮葡萄球菌感染呈慢性、持续性和反复性特点，很难彻底治愈，给临床治疗带来了极大的挑战。表皮葡萄球菌生物膜的形成是一个复杂过程，需多种基因及其调控因子参与，如胞间黏附素基因（intercellular adhesion gene，ica）参与调控合成的多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA），是生物膜形成所必须的成分，附属基因调节子（accessory gene regulator，agr）在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中起中心调节作用。现就表皮葡萄球菌生物膜形成的相关基因调控及其在临床生物材料植入感染中的作用作一综述。

1 表皮葡萄球菌生物膜的形成

表皮葡萄球菌是生物材料植入引发细菌生物膜感染的常见机会致病菌之一。生物材料表面细菌生物膜的形成是此类细菌引起的感染难治愈的主要原因，在临床上造成了极高的患病率和死亡率，究其原因这与细菌生物膜的形成过程及结构密不可分。

1.1 表皮葡萄球菌生物膜的组成成分和结构特征

细菌生物膜是细菌附着在有生命或无生命的物体表面，被自身所分泌的胞外黏质物（主要是多聚糖）包裹的具有高度组织化的多细胞菌落结构[6]。其主要成分为多糖及一些相关蛋白质。成熟的生物膜具有被称为塔或蘑菇的特殊三维结构，中间被充满液体的通道分隔，这些通道可向生物膜中的细菌输送营养物质并排除细菌产生的废物[7]。研究发现，表皮葡萄球菌生物膜由活、死细菌构成，分内、中、外3层；成熟生物膜中各层活、死细菌分布不均，死细菌主要集中在中心区域，活细菌则由内向外逐渐增加[8]。表皮葡萄球菌生物膜的形成对细菌具有良好的保护作用，体外研究发现，生物膜中的细菌抵御抗生素的能力比浮游状态下高500～1 000倍[5]，加之细菌生物膜具有可播散的特点，因此在临床上细菌生物膜感染难以根除，往往只有通过手术移除相关医疗器械和去除周围受感染的组织才可消除[9-10]。

1.2 表皮葡萄球菌生物膜的形成过程

表皮葡萄球菌生物膜的形成是一个复杂过程，需多种因子参与，其形成过程包括两个阶段，即初始黏附阶段和聚集阶段[11]。表皮葡萄球菌首先非特异性黏附在医用生物材料表面，随后相互聚集形成具有多层结构的牢固生物膜。表皮葡萄球菌初始黏附阶段需要多种因子参与，如荚膜多糖黏附素（capsular polysaccharide adhesion，PSA）、葡萄球菌自溶素E（autolysin E，AtlE）、纤维蛋白原结合蛋白（fibrinogen-binding protein，Fbe）等。聚集阶段主要由PIA介导，此外还可通过聚集相关蛋白（accumulationassociated protein，App）等因子介导[12]。

表皮葡萄球菌生物膜的形成过程受多种基因调节，其中由ica操纵子编码的PIA被认为是最重要的黏附因子，与其他物质如磷壁酸、蛋白质等一起构成胞外基质的主要成分[13]。研究发现，表皮葡萄球菌生物膜的形成可分为PIA依赖途径（多糖生物膜）和PIA非依赖途径（蛋白质生物膜）[11，14]，但绝大多数表皮葡萄球菌生物膜的形成是由PIA介导的[15]。因此，可认为PIA是表皮葡萄球菌生物膜形成所必须的成分。

2 多糖胞间黏附素的合成和ica操纵子

在多糖生物膜的形成过程中，表皮葡萄球菌主要产生两种多糖即PSA和PIA，其在生物膜的形成过程中起着重要作用，分别参与生物膜形成的初始黏附阶段和聚集阶段。研究表明，这两种多糖均由ica操纵子编码产生[16-17]，其中PIA在生物膜的形成过程中显得尤为重要。

2.1 PIA的组成成分及调节因素

PIA的产生被认为是表皮葡萄球菌相关医疗器械感染的一个重要毒力因子，其化学成分为β1，6-N-乙酰氨基葡萄糖，也称为聚-N-乙酰氨基葡萄糖（poly N-acetylglucosamine，PNAG），它是一种特殊的多糖抗原，最初是从表皮葡萄球菌菌株1457和RP62A中分离而来[18]。PIA/PNAG的合成主要取决于ica操纵子编码的PIA合成酶[19]。此外，还受体外多种环境因素的影响，如高温、微氧条件、高渗透压、葡萄糖、乙醇、某些亚抑菌浓度的抗生素均可诱导其合成[20]，从而影响细菌生物膜的形成。

2.2 ica操纵子的结构和功能

ica操纵子由icaA、icaD、icaB和icaC构成，它们分别编码的IcaA、IcaD、IcaB和IcaC 4种蛋白共同参与PIA的合成。IcaA和IcaD均是跨膜蛋白，两者共同构成一种N-乙酰葡萄糖氨基转移酶参与PNAG寡聚物的合成；IcaC作为一种膜蛋白,可将IcaA合成的寡聚物输送至细胞膜表面，通过表面酶IcaB部分脱乙酰基作用形成带正电荷的聚合物，即PIA/PNAG。ica操纵子具有调控PIA/PNAG生物合成的作用是在发生转座子插入突变的表皮葡萄球菌O-47中首次发现的。目前的研究表明，ica操纵子的表达已成为评价表皮葡萄球菌感染致病性的毒力标志，可据其将医源性表皮葡萄球菌分为ica操纵子阴性和ica操纵子阳性两类细菌[4，21]。据文献报道，不同来源的表皮葡萄球菌，其细菌生物膜形成的相关基因（icaADBC）阳性率亦不同，临床导管或植入物相关感染患者中分离出的表皮葡萄球菌明显高于正常人[7，22]。

2.3 ica操纵子表达的调节

表皮葡萄球菌icaADBC的表达受多种调节因子的影响，如IcaR、替考拉宁相关基因调节子（the teicoplanin-associated locus regulator，TcaR）、σβ、全局调控蛋白SarA、生物膜形成相关的蛋白调节子（protein regulator of biofilm formation，Rbf）、插入序列IS256等，此外一些环境因素如高渗、葡萄糖、乙醇、某些亚抑菌浓度的抗生素等也可影响其表达。表皮葡萄球菌来源不同以及来源相同但培养方式不同的菌株，其调节ica基因表达的机制也存在一定差异。

2.3.1 IcaR

IcaR是转录调节子TetR蛋白家族成员之一[9]，其分子质量约为22 ku。IcaR的调控基因icaR位于icaADBC操纵子的上游，两者的转录方向截然不同。氨基酸序列对比研究首次证明了icaR的基因产物是一种转录调节子[23]。IcaR是一种能抑制icaADBC表达的转录阻遏蛋白[24]，其与ica操纵子之间的关系最初是在表皮葡萄球菌CSF41498临床分离株中发现的。IcaR抑制icaADBC表达的作用主要体现在其5'端可与icaA基因转录起始点结合从而抑制ica操纵子的转录，影响生物膜的形成。有文献报道，应激反应全局调控蛋白（global regulator of stress response，Spx）可促进icaR基因的表达，而Rbf可抑制icaR基因的表达[1]。此外，icaR基因还受环境因素的影响，如乙醇、葡萄糖可以通过抑制icaR基因的转录促使ica操纵子的表达增加。

2.3.2 TcaR

体外研究发现，TcaR与ica启动子之间存在密切关系[25]。TcaR是多重耐药调控蛋白（multiple antibiotic resistance regulator，MarR）家族成员之一，可参与葡萄球菌对替考拉宁和甲氧西林耐药机制的调节[26]。MarR家族蛋白均是同源二聚体，每个单体均含有一个翼状螺旋-转角-螺旋（wHTH）DNA结合区域，其作用为调控蛋白质的表达，并可抵御多重抗生素、消毒剂、有机溶剂毒力因子和氧化应激药物的攻击。现已证实，MarR类蛋白具有正、负调节或双重调节功能，此外TcaR还可作为多功能调控因子[27-28]。据文献报道，TcaR与IcaR一样能负性调节表皮葡萄球菌icaADBC的表达，但TcaR对icaADBC的负性调节能力较弱，而IcaR的调节能力很强[25]；两者可相互协同调节icaA的转录、PNAG的产生和生物膜的形成[27]。同时，TcaR还可与双链DNA（dsDNA）及单链DNA（ssDNA）结合，病毒ssDNA M13转化至表皮葡萄球菌中可促进TcaR的表达[29]。

2.3.3 σβ

σβ是从葡萄球菌和其他革兰氏阳性菌中发现的一种选择性σ因子，其在应对环境压力方面起重要作用。葡萄球菌σβ操纵子由rsbU、rsbV、rsbW和sigB 4种基因构成，其中rsbU基因是一个能直接感受外界环境变化并能将变化信号通过一系列的磷酸化传递给σβ因子的重要基因。RsbU和RsbV是σβ活性的正性调控因子，而RsbW则为负性调控因子。磷酸酶RsbU可通过RsbV的去磷酸化作用来启动压力反应，抗抗σ因子RsbV与RsbW-σβ复合物结合后可促进σβ蛋白与RNA聚合物分离并相互作用。现已从表皮葡萄球菌1457中发现σβ因子可调节表皮葡萄球菌生物膜的形成[30]。σβ因子可通过下调icaR的表达间接影响表皮葡萄球菌icaADBC的转录，从而影响生物膜的形成[31]。此外，RsbU的活化是表皮葡萄球菌生物膜形成和PIA合成所必须的，某些环境因素如高盐可通过rsbU基因启动σβ操纵子，增强icaADBC的转录水平，促进PIA的产生及生物膜的形成。

2.3.4 Spx

Spx是存在于革兰氏阳性菌中的一种全局转录调控蛋白，受ClpP蛋白酶的调节。ClpP突变的表皮葡萄球菌菌株Spx的表达水平较高。此外，Spx可能是一种表皮葡萄球菌ClpP蛋白酶底物。研究表明，Spx可抑制表皮葡萄球菌icaADBC的转录，从而降低PIA的产生，影响生物膜的形成，其抑制icaADBC转录的途径并非像金黄色葡萄球菌一样通过正性调节icaR的转录来间接实现，其可能是通过直接方式或下调ica操纵子的正性调控因子如SarA或SarZ从而间接抑制icaADBC的转录[32]。

2.3.5 Sar蛋白家族

对金黄色葡萄球菌的研究发现，Sar蛋白家族至少由12种不同的蛋白构成，包括SarA、SarR、SarS、SarU、SarX、SarV、Rot、MgrA等，它们相互作用形成一个复杂的调节网络。Sar蛋白家族分为以下3类：单域蛋白、双域蛋白和MarR同源物。其中的某些蛋白也同样存在于表皮葡萄球菌中。

SarA是由sarA基因编码的含有124个氨基酸残基的二聚DNA结合蛋白，它是表皮葡萄球菌Sar蛋白家族中研究最为深入的蛋白，由启动子P1、P3和P2驱动的3种不同重叠转录子构成，含有4个α螺旋中心结构和1个β折叠结构。SarA蛋白可以直接或间接的方式影响靶基因的表达。研究发现，SarA不仅可通过提高表皮葡萄球菌ica操纵子的转录水平促进生物膜的形成，还与表皮葡萄球菌的耐药性密切相关[33]。研究还发现，在金黄色葡萄球菌中首次发现的、含有141个氨基酸残基的单域蛋白SarX可特异性地与表皮葡萄球菌icaADBC启动子结合，从而提高icaADBC的转录水平，促进PIA的合成和生物膜的形成[34]；而Rbf可通过上调SarX的合成促进icaADBC的表达[35]。

研究表明，SarZ也可影响表皮葡萄球菌1457 ica操纵子的表达。SarZ是MarR同源物亚家族成员之一，是一个含148个氨基酸残基的蛋白，其可通过icaR非依赖途径促进表皮葡萄球菌ica操纵子的转录水平，从而影响生物膜的形成。另外，SarZ还可影响参与调节脂肪酶、蛋白酶在内的基因的表达[36]。

icaADBC的表达除受上述几种基因调控蛋白的影响外，还受Ygs、SrrAB、LuxS、Rbf、CcpA等基因调控蛋白的影响。表皮葡萄球菌生物膜的形成是一个多基因多因素参与的过程，随着研究的不断深入，现已发现表皮葡萄球菌agr在细菌生物膜形成的群体感应系统中发挥着重要作用。

3 表皮葡萄球菌agr

表皮葡萄球菌含有agr和lu xS两种群体感应系统（Quorum-sensing system，QS系统）。luxS可通过合成自体诱导物2（autoinducer2，AI2）降低表皮葡萄球菌ica基因的转录水平来影响生物膜的形成；而agr在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中起中心作用，其可能是表皮葡萄球菌最为重要的毒力因子调节系统。

3.1 agr的组成及作用

agr基因由agrB、agrD、agrC和agrA构成，编码P2和P3两种双向转录启动子，分别表达RNAⅡ和RNAⅢ。其中，P2还参与调节agr基因的表达。agrD编码产生的群体感应分子自诱导肽（autoinducing peptide，AIP）通过AgrB的加工和分泌，被AgrC和AgrA组成的双组份信号传导系统所识别；当AIP达到一定浓度后可激活AgrC，促进调节子AgrA的磷酸化，从而激活P2启动子，完成自体诱导活化过程。另外，AgrA也可促进P3启动子的转录，增加RNAⅢ的合成。RNAⅢ是agr系统的主要效应分子，不仅可抑制表面蛋白基因（如纤连蛋白结合蛋白）的表达，还可促进溶血性外毒素基因（如hld）的表达[37]。据文献报道，表皮葡萄球菌菌株存在3种agr，但目前确定的自体活化信号只有AIP-Ⅰ一种。有学者对3种agr系统间的相互关系做了研究，结果表明，agr-Ⅰ与agr-Ⅱ及agr-Ⅲ间分别存在相互抑制关系，而agr-Ⅱ和agr-Ⅲ间并无相关性[38]。

agr系统的功能主要由RNAⅢ来实现。RNAⅢ除可调控多种胞外蛋白基因的表达外，其编码的σ-毒素具有去垢剂样的理化性质，可以剂量依赖的方式防止表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面[39]。现已证实，agr基因可介导表皮葡萄球菌毒力因子的表达，其在表皮葡萄球菌的侵袭性和生物膜上细菌的可传播性方面具有重要意义。

agr系统以细胞密度依赖的方式调节目的基因的表达，不仅可下调细胞表面蛋白的表达，还可上调胞外酶的表达，如脂肪酶、蛋白酶等。现有研究表明，对于agr突变的表皮葡萄球菌菌株，其生物膜的形成能力、初始黏附和自溶素AtlE的表达水平均增强，但缺乏σ-毒素的形成[39]。此外，agr可严格调节表皮葡萄球菌所产生的氨基酸肽复合物——酚可溶性调控蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）的合成。PSM对人体先天性免疫应答系统具有强烈的刺激作用，在生物膜感染的传播方面起重要作用。通过agr的调节可增强PSM的促炎症反应和趋化作用，从而抑制生物膜的形成[38，40]。agr系统不仅能在质和量上影响其分泌的蛋白和致病因子，还可通过改变表皮葡萄球菌营养物质的供求影响整个代谢过程[41]。

3.2 agr的调控因素

agr除影响表皮葡萄球菌生物膜的形成外，其自身也受RNAⅢ活化蛋白（RNAⅢ-activating protein，RAP）等调控因素的影响。RAP可通过诱导其靶向分子TRAP的磷酸化来激活agr系统。TRAP是葡萄球菌中一种高度保守的膜相关蛋白，当其处于不表达或去磷酸化状态时，不能促使细菌的黏附、生物膜的形成和毒素的表达，也不能引起疾病的发生。与RAP的一段结构相似的RNAⅢ抑制肽（RNAⅢ-inhibiting peptide，RIP）可竞争性地与TRAP结合，从而抑制TRAP的磷酸化和agr的表达[42]。另外，SarX也可通过与agr系统P3启动子发生特异性结合来抑制agr的表达和胞外蛋白的产生[34]。

目前，关于上述两种基因（ica和agr）与表皮葡萄球菌生物膜形成的研究大多基于实验突变株。然而，在生物材料相关的临床感染中，细菌生物膜的形成过程和组织结构与一般感染不同。

4 生物材料植入感染中表皮葡萄球菌ica操纵子和agr的作用

表皮葡萄球菌的遗传背景不同，表现出的生物学特性也不同，其能否形成生物膜与细菌生物膜的特性及其自身结构有关。研究发现，医源性表皮葡萄球菌ica操纵子在生物材料表面细菌生物膜形成中具有重要作用，能增加生物材料表面细菌群落数量及细菌生物膜厚度，其可能是区分共生性和侵袭性表皮葡萄球菌的遗传基础，因此可将医源性表皮葡萄球菌分为ica操纵子阴性和阳性两类细菌[22]。此外，研究还发现，表皮葡萄球菌ica操纵子是临床表皮葡萄球菌感染最为重要的毒力标记[4]，可用于区分临床表皮葡萄球菌致病力的强弱。医源性表皮葡萄球菌agr同样在生物材料植入感染中发挥着重要作用，通过调节多种毒力因子的表达影响生物膜的形成[16]，有望成为临床表皮葡萄球菌致病力的重要分子标记。

5 结语

表皮葡萄球菌生物膜是细菌适应环境变化的一种保护性生存方式，其形成需多基因和多因素参与，具有抵御抗生素治疗和宿主免疫应答系统的能力，是造成临床生物材料相关感染难治性的主要原因。如何有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成是目前临床治疗生物材料相关感染亟需解决的问题。目前的研究已对表皮葡萄球菌ica操纵子在临床生物材料相关感染中的作用及其体内环境影响因素、是否可作为评价表皮葡萄球菌致病力的分子标记等方面做了很好的阐释，但对表皮葡萄球菌agr在临床生物材料植入感染中的具体作用、体内环境对其转录水平的影响以及其是否可作为临床表皮葡萄球菌毒力标记等方面尚待进一步研究，以期为临床生物材料植入感染的防治提供实验依据

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Biomaterial implantation associted infection and related gene regulation of biofilm formation by Staphylococcus epidermidis

Qiu Liangting,Ye Lianhua,Huang Yunchao
Department of Cardiothoracic Surgery,the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650118,China
Corresponding author:Ye Lianhua,Email:Lhye1204@aliyun.com

Staphylococcus epidermidis is a commensal bacteria which inhabits on the surface of human skin and mucous membrane.It has been demonstrated that staphylococcus epidermidis is a major opportunistic pathogen that can cause clinical biomaterial related infection and plays an important role in biomaterial implantation associated infections.The main pathogenic factor is the formation of the bacterial biofilm on surface of medical biomaterial.The formation of bacterial biofilm can resist the defense reaction and antibiotic treatment effectively so that leading to the biomaterial implantation associated infection which is difficult to cure thoroughly,and make the infections become chronic,persistent and repetitive.Nowadays,the infections caused by Staphylococcus epidermidis have caused high clinical mortality.Staphylococcus epidermidis biofilm formation,the regulations of intercellular adhesion gene(ica) operon and accessory gene regulator(agr)gene on the formation of biofilm and their functions in clinical biomaterial related infections are reviewed in this article.

Staphylococcus epidermidis;Biofilm;ica operon;agr gene;Biomaterial

叶联华，Email：Lhye1204@aliyun.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．01．009

国家自然科学基金（81260228，81460278）；云南省自然科学基金（2013FZ267，2014FA048）；云南省高层次人才培养基金项目（No．2012HB032，D-201222）

2015-10-20）